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PFGE原理及注意事项 脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替转变完成分别大分子DNA。PFGE留意事项：：蠕动泵的流速：电泳过程中，掌握好蠕动泵的流速，一般掌握在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中挪动。冷却泵的开启：冷却泵开启时，肯定要把蠕动泵翻开，以避开冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝聚成冰块而堵塞管道。电泳完毕后，应准时取出凝胶，进展染色等操作，以避开因为时间太长，而造成条带的弥散。脉冲场凝胶电泳〔PFGE〕的原理脉冲场凝胶电泳〔PFGE〕的原理大致为:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进展酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及适宜的脉冲时间等条件下而得到良好的分别。PFGE中内切酶的选用至关重要,所采纳的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,合适于作PFGE电泳。McClelland等[8]通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择讨论发觉,四核苷酸CTAG在很多GC含量45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。同样地,在很多含Ｇ+Ｃ45%的基因组,CCG和CGG更少。这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进展酶切,对产生平均超过100000bps片段是特别适宜的。对PFGE结果的观看,可因不同讨论者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的讨论提出了PFGE的说明标准:(1)一样(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小一样,流行病学上那么认为一样,这种经PFGE证明的结果,用其它方法检测不行能显示本质性的差异。(2)严密相关(closely related): PFGE试验中,其它克隆株与爆发克隆株有全都的单一基因大事的转变,如点突变、插入或ＤＮＡ缺失。典型的状况下,这种改变可导致2～3条带的差异,当一些分别菌株被屡次重复培育或自同一病人屡次分别时可观看到这种现象。(3)可能相关(possibly related):两个独立的基因状况所致的全都的差异,如出现了4～6条带差异,此时能用简洁的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位点的获得或缺失来说明。这些菌株与爆发株间遗传基因不严密相关,流行病学上也不大可能相关,在长于6个月时间及大范围的爆发中搜集的菌株可出现这类状况。(4)不相关(unrelated):1个分别菌株通过3个更多个独立的基因大事所致的全都的转变,其PFGE图谱与爆发克隆株款式不同,那么可认为与爆发克隆株不相关(一般总有7个或更多个条带的差异)。典型状况下,这一分别株常只有少于50%的良好的分别的片段出如今爆发株图谱款式中。