实验一质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳.ppt

第一页 载体构建过程 一、质粒DNA的提取及电泳检测 二、目的基因的PCR扩增及产物检测 三、DNA的定性定量分析及酶切产物检测 质粒双酶切 PCR产物双酶切 四、酶切产物及PCR产物的纯化及检测 五、DNA的连接及检测 六、大肠杆菌的培养和超级感受态细胞的制备 七、质粒DNA的原核转化和蓝白斑筛选 酶切产物+酶切产物 T载体+PCR产物 第二页 实验学时：6 学时 实验类型：综合性 每组人数： 4 人／组 实验一 质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 第三页 一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法。 一、碱裂解法小量制备质粒DNA 第四页 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 20～200个拷贝 /细胞 严紧型质粒 1～2个拷贝 /细胞 实验背景 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 第五页 由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的MCS处的Xba?I和Sal?I识别位点之间插入了EcoR?V识别位点，用EcoR?V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有PCR?产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 复制起点 筛选标记基因 多克隆位点 第六页 二、实验原理  高碱 细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。 高酸中和至中性 变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物 质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 纯化 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质 第七页 SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 第八页 三、仪器、材料与试剂 (一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅 (二)材料 1．含连接外源基因质 粒的E. coli 2．1.5mL Eppendorf管 3．吸头、微量移液器 第九页 Solution I 50mmol／L 葡萄糖 25mmol／L Tris·HCl(pH8.0) 10 mmol／L EDTA (三)主要试剂 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲) 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒 (保护作用) EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用） Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用） 第十页 Solution II 0.4mol/LNaOH，2％SDS, 用前等体积混合 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） 第十一页 溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离) HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 Solution III 5mol／L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11．5mL 水