实验一纸层析法分离鉴定氨基酸.ppt

18 实验一纸层析法分离鉴定氨基酸 第一页 18 【二、实验原理】 层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等 第二页 18 固定相 在层析中起分离作用而不随层析过程移动的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。 流动相 在层析过程因其本身流动而推动样品移动的物质。 第三页 18 名称 操作方式 固定相 流动相 分离依据 分配层析 纸层析 薄层层析 液体 液体 溶解度 离子交换层析 离子交换柱层析 固体 液体 带电性 静电引力 吸附层析 吸附薄层层析 气体吸附层析 固体 液体 气体 吸附力 亲和层析 酶与底物 抗原与抗体 固体 液体 配体专一性 凝胶层析 凝胶过滤 固体 液体 分子大小 层析的分类 第四页 18 分配层析：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一种技术。 分配系数 = 溶质在固定相的溶解度 溶质在流动相的溶解度 第五页 18 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析：纸纤维上的 –OH 基具有亲水性，所以能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。流动相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配而得到分离。 第六页 18 溶质在滤纸上的移动速率用Ｒf（比移）值来表示： 展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = -------------------------------------------- 溶剂前沿与原点之间的距离 第七页 18 第八页 18 影响Rf值的因素（多种） 物质结构与极性 物质的极性大小决定了物质在水 和有机溶剂之间的分配情况。 pH值 展层剂的pH影响被分离物质的极性基团的解离形式。 层析滤纸的质量 层析用滤纸要质地均匀，紧密， 有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可 用于一般的纸层析。 第九页 18 【三、器材与试剂】 器材： 1、层析缸?? 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号) 试剂： 1、扩展剂 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1） 2、显色剂??? 0.1％茚三酮正丁醇溶液。 3、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液 及它们的混合液 第十页 18 1、层析滤纸准备：取层析滤纸(长20 cm、宽15 cm)一张。在纸的一端距边缘2～3 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。 2、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。 【四、实验步骤】 第十一页 18 3、扩展 ：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm）。待溶剂上升约15 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 4、显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 5、计算Rf值 第十二页