基因工程33基因操作的工具酶.pptxVIP

3.3 DNA聚合酶 DNA聚合酶 ：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。 反应特点 ： (1) 以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物 (2) 反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定 (3) 聚合反应需要有引物存在，且引物要有3’-OH游离基团 (4) DNA链的生长方向为5’? 3’ (5) 产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）; DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。 种类 ： 到目前为止，已从E.coli 中发现了Pol I、Pol II、Pol III三种DNA聚合酶 。其中Pol I 和Pol II的主要功能是参与DNA的修复过程，Pol III与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有Pol I 同分子克隆关系密切。;3.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶 I（E.coli DNA Pol I） DNA Pol I是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65? DNA Pol I已得到高度纯化，从100 kg大肠杆菌中可以分离到约500 mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的Pol I。;1. DNA Pol I在空间结构上有三个位点： (1) DNA模板结合位点——结合模板 (2) 核苷酸-磷酸结合位点——结合引物 (3) dNTP结合位点——结合底物 ;2. DNA Pol I是一种多功能酶： (1) 5’? 3’的聚合酶活性 催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3’-OH末端，沿着引物的3’-OH方向按模板顺序从5’? 3’延伸。 每分子DNA pol I每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。;(2) 5’? 3’的外切酶活性 只作用于双链DNA（dsDNA） ，从5’端切割下一个个单核苷酸。 ;(3) 3’? 5’的外切酶活性 能从游离的3’末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。 ; 在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3’? 5’外切酶活性受到5’? 3’聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由3’? 5’外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以3’? 5’核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。 ;3. E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途: (1) 可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组 (2) 用于DNA序列分析 (3) 用于制备DNA探针 在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’? 3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5’一侧的核苷酸不断地被移去，3’一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动——缺口平移（Nick Translation）。; 应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25 ?l总体积中含有1 ?g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNase I、pol I、??32P?dNTP和未标记的dNTP。 脱氧核糖核苷酸酶 I（DNase I）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸末端的单（寡）核苷酸。 ;; 由于32P?dNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32P?dNTP（2 ?mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20 ?mol/L）。而且就大多数实验的要求，使用一种32P?dNTP就足够了，其他3种均可采用未标记的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32P?dNTP。 改变反应体系中DNase I的数量，可以控制32P?dNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32P?dNTP参入DNA链。;3.3.2 大肠杆菌DNA聚合酶 I的Klenow片段 （E.coli DNA Pol I Klenow fragment） 用蛋白酶将DNA Pol I 作有限水解，可得到分子量为75000 dal和36000 dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有5’? 3’的聚合酶活性和3’?