09第九章分子标记技术及其应用.pptxVIP

分子标记技术及其应用;一、标记的发展;3、生化标记 主要指蛋白标记，包括贮藏蛋白和酶蛋白，特别是同工酶标记。能直接反映基因产物的差异且受环境影响小。但同工酶表达有组织和发育阶段特异性、多态性低、染色及电泳又需因酶不同而调整，所以其实际利用受到一定的限制。 4、DNA标记 DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，因此，DNA标记在数量上几乎是无限的。;二、分子标记的特点;三、分子标记的类型; 2、基于PCR的DNA标记 根据所用引物的特点，这类DNA标记可分为随机引物 PCR标记和特异引物PCR标记。 随机引物PCR标记过去主要有RAPD,近年来发展了一种新型标记：SRAP; 特异引物PCR标记一般主要是指SSR标记。 ; 3、基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 这类DNA标记可分为两种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP；另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS。 ; 4、基于单核苷酸多态性的DNA标记 一般是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性，如SNP。;四、几种分子标记的介绍;RFLP包括以下基本步骤： （1）DNA提取； （2）用DNA限制性内切酶消化； （3）凝胶电泳分离限制性片段； （4）将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上； （5）用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）； （6）放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。 ;RFLP原理图;产生多态性的原因是内切酶位点的变化。原位点的消失；新位点的产生。;RFLP标记的主要特点： （1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的； （2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。;由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。 1、RAPD标记的引物 所用引物的核苷酸序列是随机的，长度通常为9-10个碱基，大约只有常规PCR引物长度的一半，使用短的PCR引物是为了提高揭示DNA多态性的能力。由于引物较短，所以在PCR中必须使用较低的退火温度，以保证引物能与模板DNA结合。设计的RAPD引物基本能覆盖整个基因组，并且已经商品化。;2、RAPD的全过程 （1）DNA提取； （2）DNA浓度、纯度和质量的估测：DNA产率一般为100-200ug/g鲜重组织，根据A260值可估测浓度而根据A260/A280（1.8）比值可估测纯度（1.0A260=50ug/ml 1cm光程）， DNA电泳也可大致检测其纯度； （3）PCR扩增（20ul体系）：A、94度预变性3分钟；B、94度变性30秒，37度复性30秒，72度延伸2分钟（40个循环）；C 、72度延伸7分钟；D、4度保温； （4）电泳：1.5%琼脂糖凝胶电泳，80V电压1小时30分； （5）泡胶、成像、拍照;RAPD原理图;预变性(92-95?C,2-5m);PCR全过程;;;;;;;;（1）将RAPD标记的特异带回收； （2）将此DNA片段连接到载体上； （3）对此DNA片段进行序列测定； （4）根据其碱基序列设计一对特异引物（18-24个碱基）； （5）以此特异引物对基因组DNA再进行PCR扩增，便可扩增得到与克隆片段同样大小的DNA片段。; 由Zabeau和Vos于1993年发明。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点。 ;AFLP技术原理和操作步骤如下： （1）用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段； （2）接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）； （3）然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的； （4）最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。;AFLP原理图;AFLP标记的主要特点有