SDS-PAGE凝胶电泳技术(原版).ppt

编辑ppt 编辑ppt SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis SDS食品科学 王玲华 一、什么是SDS 十二烷基硫酸钠 一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 和分子团的混合形式存在。 SDS的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质解聚而改变原有的构象，保证解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 二、SDS的基本原理 （一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入阴离子去污剂SDS和强还原剂后，蛋白质分子解聚，与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而蛋白质原有电荷因素可以被忽略。 1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal）  二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 蛋白质-SDS复合物的特点：（1）形状像一个长椭圆棒。（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 （4）所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋白质分子间原有电荷差异。 复合物在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 3、影响SDS电泳的关键因素（1） 溶液中SDS单体浓度（1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4（2） 样品缓冲液的离子强度（不0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。 （3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。 （二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。 电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液2、Tris-醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品。5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量 （三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度. 凝胶浓度与被分离蛋白质分子量大小关系如表1 样品 分子量范围 分离胶浓度（%） 蛋白质 ＜104 20-30 （1-4）×104 15-20 4×（104-105） 10-15 （1-5）×105 5-10 ＞5×105 2-5 核酸 ＜104 15-20 104-105 5-10 105-2×105 2-2.6 三、分离方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳 （2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同  连续电泳