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激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解 激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和 装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理 从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。 1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差 1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源 逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号, 并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中, 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像, 得到的图像是数字化的, 可以在电脑中进行处理, 再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管, 可以将很微弱的信号放大, 灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合, 是现代技术发展的必然产物。 2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用 目前, 一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜, 它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合, 如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ 、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ 等, 因此被称为万能显微镜, 通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。 2．1观察活细胞、活组织ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下, 对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等; 而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。 2．2 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针, 对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平, 还可以定位到亚细胞水平和分子水平 2．3 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描, 就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。 2．4 数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机, 得到的图像是数字化的, 可及时输出或长期储存, 而且还可进一步加工处理。 2．5 定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色, 样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比, 如果其余条件固定, 通过对比各组样品之间的荧光强度值, 可得出特定成分的含量比。 3 华中地区有激光共聚焦显微镜机构的品牌和技术参数 3．1中国科学院武汉病毒研究所， 3．2湖南中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所 LSCM(BIO-ROD1024,HOMEL HEMPSTEAD,UK 发表过应用激光扫描共聚焦显微镜观察骨组织为损伤的实验研究 3．3华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科 激光扫描共聚焦显微镜(ＭＲＣ 1024型, 美国ＢｉｏＲａｄ公司生产 发表过激光扫描共聚焦显微镜检测核因子κＢ 4 激光扫描共聚焦显微镜的使用（cAMP 在体测量为例） 4．1样品制备 4．1．1切片 实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论 是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用的贴附剂有：多聚赖氨 酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶cell-Tak, vectabond等。 4．1．2培养细胞 培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器时所带的薄底培养瓶进行培养 则更佳 4．1．3激光共聚焦观察样品处理注意事项 首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在显微镜下成像，除将