医学基因工程和其医学应用.ppt

医学基因工程和其医学应用;概论;基因重组: 不一样DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。;;;pSC101;;第一节 基因工程概念;克隆 来自同一始祖相同拷贝集合。;DNA克隆 应用酶学方法, 在体外将一些遗传物质DNA与载体DNA结合, 形成一个含有自我复制能力DNA分子, 转化至宿主细胞中, 进行扩增、提取取得大量同一DNA分子。;;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等; ; 根据人愿望设计和建造非天然基因表示体系。;第 二 节自然界基因重组 DNA Recombination;一、接合作??;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;二、转化作用;例: 溶菌时, 裂解DNA片段被另一细菌摄取。;三、转导作用;λ噬菌体生活史;;发生在同源序列间重组称为同源重组(homologous recombination), 又称基础重组。是最基础DNA重组方法, 经过链断裂和再连接, 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段交换。 ;;例 λ噬菌体DNA整合 λ噬菌体整合酶识别噬菌体和宿主染色体特异靶位点发生选择性整合; 反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA长末端反复序列(long terminal repeat, LTR)。 ;（三）转座重组;第 三 节 基因工程关键技术;一、关键技术工具;重组DNA技术中常见工具酶;限制性核酸内切酶;作用 与甲基化酶共同组成细菌限制修饰系统, 限制外源DNA, 保护本身DNA。;第一个字母取自产生该酶细菌属名, 用大写; 第二、第三个字母是该细菌种名, 用小写; 第四个字母代表株; 用罗马数字表示发觉前后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;同功异源酶 起源不一样限制酶, 但能识别和切割同一位点, 这些酶称同功异源酶。;同尾酶 有些限制性内切酶即使识别序列不完全相同, 但切割DNA后, 产生相同粘性末端, 称为同尾酶。这两个相同粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;（二）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入外源DNA序列被扩增而特意设计载体称为克隆载体。 表示载体(expression vector) 为使插入外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计载体称为表示载体。;载体选择标准;1. 质粒 (plasmid);;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型, 适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型, 适用基因组克隆）;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造载体 （如腺病毒, 腺病毒相关病毒, 逆转录病毒）;（一）核酸探针与分子杂交;复性;探针技术; DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体分析。; 其她 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip);三种印迹技术比较;DNA点阵;5?;Cycle 3;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;PCR基础反应步骤;1 目基因克隆 2 基因体外突变 3 DNA和RNA微量分析 4 DNA序列测定 5 基因突变分析;三、重组DNA技术基础原理; 以 质 粒 为 载 体 DNA 克 隆 过 程;（一）目基因获取;* 化学合成法获取目基因;组织或细胞染色体DNA;mRNA ;（三）外源基因与载体连接;Bam HⅠ切割反应;2. 平端连接 适适用于: 限制性内切酶切割产生平端 粘端补齐或切平形成平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)作用下, 在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端, 再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新酶切位点, 再用限制酶切除产生粘性末端, 而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺点 处于感受态(competent) ;（五）重组体筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标识选择 (2) 标志补救(marker