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酵母双杂实验操作手册和注意事项 酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项 一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1?C147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息 1 pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86?C708) and the GAL4 AD (a.a. 768?C881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced. 三．实验主要流程 A.需要准备的药品和设备 1.两种酵母菌种(AH109,Y187) 2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acids Agar (for plates only) sterile 10×Dropout S