MicroRNA―146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制.pdfVIP

MicroRNA ―146a 调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制 DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.04.017 基金项目：国家自然科学 ）;国家自然科学基 金青年基金（ ） 作者单位： 276003 山东省临沂，临沂市人民医院重症 医学科（张建国、陈晓娟） ;南昌大学第一附属医院重症医学 科（丁成志、邵强、曾振国、刘芬、钱克俭） 通信作者：钱克俭， Email：qkj0607@ microRNA 是一类大小约 22 个核苷酸长度的内源性非编 码小分子 RNA[1]，主要通过识别并结合靶基因 mRNA 的 3 ’ 端非编码区，在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的 降解 [2-3] 。有研究发现微小 RNA参与肺内炎症反应的调控 [4] ， miR-146a 是其中较有代表性的一个。 本课题组前期研究发现， 用 LPS刺激肺泡巨噬细胞， miR-146a 的表达水平升高，并且 升高程度与 TNF-α mRNA 呈负相关 [5]; 转染 miR-146a 能下调 LPS诱导肺泡巨噬细胞 TNF-α的表达 [6] ，表明 miR-146a 能抑 制 LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。本实验拟进一步探讨 miR-146a 调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制， 为体内试验提 供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 大鼠肺泡巨噬细胞 NR8383 （上海中国科学院细胞 库）;LPS（E.coli 0111：B4）;Pre-miRlt;supgt;TMlt;/supgt; miR-146a 前体、 CyTM3 标记的 Pre-miRlt;supgt;TMlt;/supgt; 阴性对照 （美国ABI 公司）; 大鼠 TNF-α ELISA 检测试剂盒（上海森雄科技实业有限公 司） ; PrimeScriptlt;supgt; ？lt;/supgt; 逆转录试剂盒、 SYBR荧光染料试剂Ⅱ （SYBRlt;supgt;？lt;/supgt; Premix Ex Taqlt;supgt;Tlt;/supgt; M Ⅱ） PCR 检测试剂盒（大 连宝生物工程有限公司） ;抗 IRAK-1 抗体，抗 TRAF-6 抗体、 抗 NF- κB p65 抗体（美国 abcam 公司）。 1.2 实验分组及处理 将体外培养的 NR8383 细胞按每孔 1.5× 10lt;supgt;6lt;/supgt; 个接种至 6 孔板，每孔 2 mL，每 组 2 个复孔。转染组转染 50 nmol/L 的 Pre-miRlt;supgt;TMlt;/supgt; miR-146a 前体，对照组转 染 50 nmol/L 的 CyTM3 标记的 Pre-miRlt;supgt;TMlt;/supgt; 阴性对照，摇匀后继续培 养 24 h ，随后加入 1 μg/mL 终质量浓度的 LPS 处理细胞 6 h，离心收集细胞和上清液， -80 ℃保存。 1.3 检测指标及方法 1.3.1 免疫荧光法观察 NF- κB