（可修改）Real-time PCR实验原理与技术.pptVIP

.......... 181h， 半定量PCR 1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大 2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差 .......... 181h， 半定量PCR实验过程 总RNA提取； 模板cDNA制作； 半定量PT-PCR： .......... 181h， 半定量PCR优化步骤 引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的一个外显子的5’端和下一个外显子的3’端。b)设计在两个离得远的外显子上。 引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或G；GC含量为40％-60％之间。如此，管家基因与目的基因的退火温度根本一致。长度一般设计为350bp-600bp之间 内参的选择 同管扩增或异管扩增的选择 PCR循环数的选择 .......... 181h， 181h， 实时荧光定量PCR实验原理与技术 胡晓 研究生实验技术 2021 -12-7 .......... 181h， qRT-PCR技术原理 一、实验原理：在 PCR 反响体系中参加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 反响进程，最后通过标准曲线对未知模板进展定量分析。 荧光信号 + 标准曲线 定量分析？ .......... 181h， qRT-PCR技术原理 Ct值(Cycle Threshold;每个反响管中荧光强度到达阈值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关系。 以不同稀释倍数的模板制备标准曲线。 实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知样本的初始拷贝数。〔定量分析〕 .......... 181h， qRT-PCR技术荧光标记方法的分类 非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA 双链构造的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。 常用染料：Pico Green 〔灵敏度高,=25pg/mL〕 SYBR I 缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。 措施：设计特异性引物，优化PCR反响条件。 .......... 181h， qRT-PCR技术荧光标记方法的分类 .......... 181h， qRT-PCR技术荧光标记方法的分类 2.特异性荧光定量PCR:以荧光共振能量转移原理为根底 水解探针法 分子信标 Scorpion引物/探针 复合探针 .......... 181h， qRT-PCR技术影响因素 样品RNA 的完整性 RNA 样品中的基因组 DNA污染 特异性良好的引物 PCR反响体系的优化 反转录所得 cDNA 的量必须准确地等于相应的mRNA的量 可靠的内标基因： TEF-2 .......... 181h， qRT-PCR技术实验操作 .......... 181h， qRT-PCR技术实验操作 阳性模板 .......... 181h， qRT-PCR技术实验操作 制作标准品阳性对照：测定阳性模板的浓度，10倍稀释为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 反响体系如下: (标准品反响体系) 序号 反响物 剂量 SYBR Green 1 染料 10μl 阳性模板上游引物F 0.5μl 阳性模板下游引物R 0.5μl dNTP 0.5μl Taq酶 1μl 阳性模板DNA 5μl ddH2O 32.5μl 总体积 50μl 3. 轻弹管底将溶液混合，短暂离心。 (内参照基因反响体系) 序号 反响物 剂量 SYBR Green 1 染料 10μl 内参照上游引物F 0.5μl 内参照下游引物R 0.5μl dNTP 0.5μl Taq酶 1μl 待测样品cDNA 5μl ddH2O 32.5μl 总体积 50μl .......... 181h， qRT-PCR技术实验操作 1、 制备用于绘制梯度稀释