感受态细胞和质粒dna的转化c.pptVIP

dam (DNA adenine methylase) DNA腺嘌呤甲基化酶 宿主菌来源的腺嘌呤甲化酶 (GmATC) 缺失 dcm (DNA cytsine methylase) DNA胞嘧啶甲基化酶 宿主菌来源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失 hsdR (host specificity defective) 宿主特异性缺陷 宿主菌来源的I型限制酶Ecok (或EcoB) 的切断部位蛋白变异 转化的外源DNA不被限制酶EcoK切断，可以进行克隆 hsdM (host specificity defective) 宿主菌来源的I型限制酶EcoK (或EcoB) 的甲基化酶部位蛋白变异 hsdS（host specificity defective） 宿主菌来源的I型限制酶EcoK (或EcoB) 的识别部位蛋白变变异 转化的外源DNA不被限制酶EocK切断，可以进行克隆 对插入DNA具有直接作用因子的缺失 第二十六页，共41页。 endA (endonuclease) 内切核酸酶 宿主菌来源的非特异性内切核酸酶I活性缺失，可以 提高纯化的质粒DNA的质量。 NcrA (methylcytsine restriction) mCG序列的甲基化活性缺失。 mcrB，C (methylcytsine restriction) GmC序列的甲基化活性缺失。 mrr (methylation requiring restricion) mA以及mC序列的甲基化活性缺失。 第二十七页，共41页。 rpsL (ribosomal protein small subunit) 由30S核糖体蛋白变异而获得链霉素 (Steptomycine)抗性 (Strr)。 gyrA (gyrase) 由DNA回旋酶亚基A的变异而获得的萘啶酮酸(Nalidxic acid) 抗性 (Nalr)。 Tn5 (transposon) 转座子变异，获得卡那霉素 (Kanamycine) 抗性(Kmr)。 Tn10 (transposon) 转座子变异，获得四环素（Tetracycline）抗性（Tetr）。 抗药性的变异 第二十八页，共41页。 lon (long form) 分解异型蛋白质的ATP依赖型蛋白分解酶活性缺失。大肠杆菌B株原来就为lon-。可抑制其表达的融合蛋白质的分解。 omp (outer membrane protein) 外膜蛋白 膜结合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表达的融合蛋白质的分解。 宿主蛋白酶缺失 第二十九页，共41页。 感受态细胞和质粒DNA的转化C 感受态细胞和质粒DNA的转化C感受态细胞和质粒DNA的转化C导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法 重组DNA导入哺乳动物细胞: DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法 酵母菌转化法: 完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法 第一页，共41页。 导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法 重组DNA导入哺乳动物细胞: DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法 酵母菌转化法: 完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法 第二页，共41页。 大肠杆菌(Escherichia coli) 大肠杆菌(Escherichia coli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。 大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、稳定期(饱和期)，约1×109 ~2×108/mL和衰老期。 第三页，共41页。 第四页，共41页。 大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。 所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。 2. 菌株的保存 第五页，共41页。