酶的分离纯化模板.pptxVIP

Chaaapter 3 The Extraaaction, Sepaaaraaation aaand Purificaaation of Enzyme酶的别离纯化制作：xxx2021-5-18Contents of chaaapter 31、酶的提取与别离纯化技术路线Go2、细胞破碎GoGo3、酶的提取4、酶的别离方法Go5、酶的组合别离纯化策略Go6、酶的浓缩、枯燥与结晶Go2021-5-18细胞结构与酶分布2021-5-183.1 酶的提取、别离纯化技术路线动物、植物或微生物细胞细胞破碎发酵液酶提取酶别离纯化酶浓缩离心别离，过滤别离，沉淀别离，层析别离，电泳别离，萃取别离，结晶别离等。酶贮存2021-5-18酶别离纯化不同阶段酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 局部纯化 (paaartiaaally purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。本章目录2021-5-183.2 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1〕机械破碎2〕物理破碎3〕化学破碎4〕酶解破碎JY92-II D超声波细胞粉碎机高压细胞破碎机细胞破碎珠DY89-I型 电动玻璃匀浆机2021-5-18细胞破碎方法及其原理捣碎法研磨法匀浆法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。机械破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 物理破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿外表活性剂：Triton、Tween通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎化学破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而到达细胞破碎自溶法外加酶制剂法酶促破碎本章目录2021-5-183.3 酶的提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，那么可用有机溶剂提取。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。2021-5-18酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。 本章目录2021-5-183.4 酶的别离方法1、沉淀别离Go2、离心别离Go3、过滤与膜别离Go4、层析别离Go5、电泳别离Go6、萃取别离Go本章目录2021-5-181、沉淀别离沉淀别离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质别离的技术过程。沉淀分离方法分离原理 盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离2021-5-18在盐浓度到达某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 在一定的温度和pH值条件下〔β为常数〕，通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质别离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下〔KsI为常数〕，通过改