临床检验技师临床免疫学和免疫检验生物素亲和素放大技术讲义.pdfVIP

第十一章 生物素 - 亲和素放大技术 第一节 生物素的理化性质与标记 一、活化生物素 利用生物素的 羧基 加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。 （一）标记蛋白质 氨基 的活化生物素 将生物素与 N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成 BLAHS。BLAHS中的 -C=0 基团与蛋白 质分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而标记上生物素。 （二）标记蛋白质 醛基 的活化生物素有两种： 生物素酰肼（ BHZ，用于偏酸性糖蛋白的生物素标记）和 肼化生物胞素（ BGHZ）。 （三）标记蛋白质 巯基 的活化生物素： 3- （N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）是能特异地与蛋白 质巯基结合的活化生物素试剂。 （四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸 探针。 1. 光敏生物素：用于 DNA或 RNA的标记。 2. 生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。用缺口移位法掺入到双链 DNA中。 3.BNHS和 BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的 N-4 氨基交联，使核酸分子生物素化。 二、生物素标记蛋白质 （一）生物素化蛋白质衍生物的特性 生物素通过 羧基 与多种大分子偶联活化。 一个蛋白质分子可连接多个生物素分子 ，在与亲和素的反应 中成为多价。 生物素化蛋白质衍生物有两类， 一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记 材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。 （二）标记方法 1. 标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应 时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。 2. 标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（ HRP）。 （三）标记注意事项 1. 应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类 （氨基、醛基或巯基） 以及分子的理化性质 （酸 性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。 2. 标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素 分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。 3. 为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可 在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。 4. 生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。 第二节 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。 一、亲和素及其活性 亲和素（ AV）耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素 能结合 4 个分子的生物素 ，二者之间的亲和力极强。 第 1 页 二、链霉亲和素及其活性 链霉亲和素（ SA）分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此一个链霉亲和素分子也能结合 4 个生物 素分子。 三、亲和素（或链霉亲和素）的标记 用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有 125I 、胶体金、 荧光素和化学发光物， 大分子物质如酶、 抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中 最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（ FITC ）和胶体金。 亲和素或链霉亲和素与酶的标记结合物的制备可用普通酶 直接标记 ，还可以通过与生物素化酶复合物 中的生物素结合， 间接 地与酶形成结合物。 第三节 生物素 - 亲和素系统的特点 一、灵敏度： 每个亲和素分子有四个生物素结合部位，因此 BAS具有多级放大作用，提高检测灵敏度。 二、特异性：