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实验四 电镜切片制作与观察 实验目的 ? 了解扫描电镜生物样品的常规制备技术，重点掌握样品的表面处理方法，临界点干燥仪和离子溅射 仪的结构与工作原理。 ? 了解生物样品超薄切片的一般制备技术，重点掌握包埋与聚合、玻璃刀的制作、修块、铜网及其支 持膜、切片厚度判断等。 ? 了解 H-7000 透射电镜的结构及其工作原理，重点是镜筒系统。 实验原理 1、电子束的特点 穿透能力有限，不超过 100nm 。 2 、电子成像机制 电子成像的反差主要源于样品散射电子能力的 差异。 3、生物样品的特点 含水量高、质地柔软、对热和电子束敏感，散射 电子的能力弱且差异小。 4 、扫描电镜及常规扫描电镜生物样品制备技术 （1）扫描电镜 扫描电镜是一种利用电子束扫描样品表面从而 获得样品信息的电子显微镜。扫描电镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统。 （2 ）扫描电镜样品制备要求 扫描电镜以观察样品的表面形态为主。 扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求：保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良 好的导电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态。 （3 ）扫描电镜样品制备流程 某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛 发、昆虫、植物种子、花粉等。 对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材 料的导电性和二次电子产额。具体步骤包括：取材、清洗、固定、脱水、干燥（置换） 、粘托、导电处理等。 5、透射电镜及超薄切片制备技术 （1）透射电镜 透射电镜是利用透射电子成像的电子显微镜。 透射式电子显微镜的总体结构包括镜体和辅助系统两大部分，镜体部分包含：照明系统（电子枪和聚 光镜）、成像放大系统（样品室、物镜、中间镜和投影镜） 、观察记录系统（观察室、照相室） 。辅助系统包 含：真空系统（机械泵、扩散泵和真空阀） 、电路系统（电源变换和调整控制） 、水冷系统。 （2 ）透射电镜样品制备要求 样品彻底干燥、要提高样品反差、样品要薄。 （3 ）超薄切片制备技术 由于一般透射电镜的电子束穿透能力较弱，必须把标本切成厚度小于 100nm 的薄片，这种薄片称为超 薄切片，超薄切片的厚度通常为 50-70nm 。 超薄切片的制作流程与石蜡切片类似，包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、修块、切片、染 色等步骤。 实验步骤 1、常规扫描电镜样品制备技术 （1）基本方法 （2 ）样品观察面的处理方法 一般表面处理方法 样品断裂面处理方法 （3 ）干燥的干燥方法 自然干燥法 真空干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法（临界点干燥仪） （4 ）样品的导电处理 真空镀膜法 离子溅射镀膜法（离子溅射仪） 组织导电技术 2 、超薄切片制备技术 （1）、基本方法 取材→漂洗（生理盐水→前固定（ 2.5% 戊二醛， 4oC 冰箱 2 小时以上）→漂洗（ 0.1M 磷酸缓冲 液 / 3 次/ 45 分钟）→后固定 (1% 锇酸 1 小时左右 ) →漂洗（ 0.1M 磷酸缓冲液 /3 次 /45 分钟）→梯度 脱水→浸透、包埋聚合→超薄切片→饱和醋酸铀染色 30 分钟，柠檬酸铅染色 5-8 分钟。 透射电镜样品制作操作流程图 （2 ）半薄切片 玻璃刀 半薄切片机 修块 （3 ）超薄切片 工具：超薄切片机、钻石刀、水槽 超薄切片流程：切片→捞片→拨片→载网 切片厚度（切片干涉色） 载网