实验六 微生物的纯化和接种技术 - 学生 (3).docxVIP

实验六 微生物的纯化和接种技术 、目的要求 掌握微生物纯化、接种技术。 2 .建立学生无菌操作意识。 二、基本原理 在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的，因此，为了取出特定的微 生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究 的基本操作技能，无菌操作是微生物接种技术的关键，几乎贯穿于所有的微生物学实验过程 中。稀释涂布平板、平板划线分离、斜面接种和穿刺接种等均是获得生长良好的纯种微生 物的分离技术。 三、实验材料与仪器 营养琼脂培养基（50ml/人）、培养皿（2个/人，需提前灭菌）、固体斜面（1个/人）、菌 种（细菌，上周培养的）、接种环（1个/I人）、酒精灯、电热套、火柴、培养箱等。 U!、实验步骤 U! 、实验步骤 （一）稀释涂布平板法（实验五巳学习） 1 .制备稀释液2.倒平板 3 .涂布 4 .培养 （二）平板划线分离法 1.倒平板 将营养琼脂培养基加热熔化，待冷却至约45°C时，无菌操作倒入灭菌培养皿中，每皿 约 15-20mLo 倒平板的方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边 （越近越好）, 用左手将瓶 塞（封口膜）轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿在焰旁灭菌，并将皿盖在 火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15-20mL,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分 布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 2 .划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取培养物（实验五培养的细菌） 一环在平板上划线。划线的方法很多（图12-4）,但无论采用哪种方法，其目的都是通过划 线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列两种（见图12.5） 图12-4平板划线方法 分区划线分离法：用接种环以无菌操作挑取培养物一环，先在平板培养基的一边做第一 次平行划线3?4条，再转动培养皿约70。角，并将接种环上剩余培养物烧掉，待冷却后通 过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分做第三次平行划 线和通过第三次平行划线部分做第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于37°C 培养箱中培养。此法适用于杂菌量较多的样品。如图A。 连续划线分离法：先将培养物在琼脂平板上开始处轻轻涂抹，然后再用接种环在平板表 面曲线连续划线接种，直至划满营养琼脂平板表面。此法常用于含菌量不多的样品。如图B。 图12-5平板划线方法 （三）斜面接种和穿刺接种 1.斜面接种法 （1） 取新鲜固体斜面培养基（现场制作），分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种 人等），然后用无菌操作方法把待接菌种（培养物）接入以上新鲜固体斜面培养基上。 （2） 接种的方法是，用接种环蘸取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方 向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。 ⑶接种后30°C恒温培养，细菌培养48h,取出保存。 图12-6斜面接种操作 2.穿刺接种法（本次实验不做） （1） 取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白腺柱状培养基，做好标记（写上菌名、接种日期、接 种人等）。 （2） 接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底 部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意勿使接种针在培养基内左右移动，以 保持穿刺线整齐，便于观察生长结果。 五、结果报告 记录划线分离的试验结果，以能够区分单菌落为佳。 实验结果记录 菌种类型 培养基名称 生长情况 有无污染及原因 六、注意事项 1、 培养容器表面不是无菌的，在接种时，要马上把容器上口在火焰上过一下。 2、 接种使用的接种工具（接种针、接种钩、接种环、接种耳等）要迅速经过火焰灭菌，注 意降温后接种。 3、 由于接种时打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验 的所有操作均应在无菌条件下进行, 其要点是在火焰附近（越近越好） 进行熟 练的无菌操作，或在无菌接种箱或操作室内无菌的环境下进行操作。