硫酸铵盐析分析和总结.pdf

硫酸铵盐析 1. 盐析的成败决定于溶液的 pH值与离子强度，溶液 pH值越接近蛋白的等电点， 蛋白质越容易沉淀。 2. 盐析一般用的硫酸铵， 容易吸潮，因而在使用前， 一般先磨碎，平铺放入 烤箱内 60 摄氏度烘干后再称量，这样更准确。 3. 在加入盐时应该缓慢均匀， 搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢， 如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐 浓度过高，导致酶失活。 4. 盐析后最好搅拌 40 分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。 3.5 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理， 以免变性，透析较慢， 一般可用超滤 或者 G-25，G-50 处理。 6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在 70%左右。 盐析法 ①原理： 盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的， 也是蛋白质和酶提纯工作应 用最早， 至今仍广泛使用的方法。 其原理是蛋白质、 酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度 升高而增加 （此时称为盐溶）； 当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下 降并先后析出， 称为蛋白质的盐析。 这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团 有着静电引力， 当水中加入少量盐类时， 由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团 的影响， 使蛋白质在水中溶解度增大。 但盐浓度增加到一定程度时， 蛋白质表面的电荷大量 被中和， 水化膜被破坏， 于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。 盐析法就根据不同蛋白质和酶 在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。 ②盐的选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸 钠等。其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（ 25℃时饱和溶解度为 4.1mol/L, 即 767g/L;0 ℃时饱和溶解度为 3.9mol/L ，即 676g/L ），在这一溶解度范围内， 许多蛋白质和酶都可以盐析出来， 而且硫酸铵价廉易得， 分段效果比其他盐好， 不容易引起 蛋白质变性。应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力比较差，故有时也应用硫酸 钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是 30℃以上溶解度太低。 其他的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好， 但也由于溶解度太低， 受温度影响大， 故应 用不广。 硫酸铵浓溶液的 pH在 4.5 ～ 5.5 之间，市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸， pH 值往往 降至 4.5 以下，当用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节 。 ③硫酸铵饱和度计算法及加入方式： 在分段盐析时， 加盐浓度一般以饱和度表示， 饱和 溶液的饱和度定为 100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有 3 种。一是当蛋白质溶 液体积不大， 所需调整的浓度不高时， 可加入饱和硫酸铵溶液； 饱和硫酸铵配制方法可加入 过量的硫酸铵， 热至 50 ～60℃保温数分钟， 趁热滤去沉淀， 再在 0℃或 25℃下平衡 1～2 天， 有固体析出时即达 100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算： 式中 V 及 V0 分别代表所需饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积， S2 及 S1 分别代