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microRNA定量PCR检测方法 microRNA定量PCR检测方法 PAGE / NUMPAGES microRNA定量PCR检测方法 microRNA 定量 PCR检测实验设计 第一特异性检测：最常用的 ABI 企业的 Taqman 探针法，其策略是 采纳发卡 RT引物反转录，随后 taqman 探针做 real-time 。ABI 的 TaqMan 探针法，设计的是颈环引 物，针对特定的 microRNA，反转后以特定的引物和探针做荧光定量。 反转录引物和 荧光定量引物及探针构成一个 assay。大部分研究的位点， 都能在 ABI 网站上找到现 成的 assay。TaqMan 探针法检测敏捷度高，当前大部分文章中都采纳的这类方法。 同时 TaqMan 探针技术是专利技术，所以相对较贵。假如资本有限，能够使用 SYBR 染料法取代， 这方面好多企业都有相应的试剂盒， 比方 TIANGEN，TaKARA等，国内 企业广州锐博或上海吉玛也能够，相对廉价一些。 其次是非特异性方法， 即总 RNA 加上 poly A 尾巴，再用 poly T 的引物做反转， 而后 SYBR Green做荧光定量。代表性的 Qiagen 方法是第一给 miRNA 加 poly（ A）+adapter ， 而后利用 adapter 的序列作为反向引物， miRNA 自己为正向引物（或许 5‘端修饰 下）。而后和一般 real-time PCR同样进行就能够了。这个能够自己设计， adapter 就是一段随即引物，尾端转移酶等。详细能够搜下有关资料。 对于 microRNA 定量 PCR的 RT引物： 1、 Oligo d(T)特异的 RT引物 吞并碱基 V 或 VN 构成。 RNA在反转录前需要进行尾端  QIAGEN产品为主 由特异序列 Oligo d (T)20 左右 全部 miRNA 能够公用一个 Oligod(T)的 RT 引物 可是 Poly(A)加尾 2、茎环状构造的 RT 引物 ABI 产品为主 由能够自己呈环茎状的特异序列 6 8 个 miRNA3’端反向互补碱基构成。 (一 条 miRNA 序列特异对应一个茎环状构造的 RT 引物 1）stem-loop RT 引物设计 ：鉴于通用的茎环构造，只要要依据不一样的 miRNA 序列 修 改 最 末 端 6 个 碱 基 即 可 。 通 用 茎 环 结 构 序 列 为 ： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 比如设计 miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的 RT 引物，只要在通用茎环序 列后架上 miRNA3’尾端的 6 个碱基的反向互补序列，即 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2）realtime 引物设计 ：上游引物 ， miRNA 序列除掉 3’端 6 个碱基的节余部分作为上游引物，如 miR-1 的上游引物为 (注意把 U 改为 T)： TGGAATGTAAAGAAGT检查.引物的 Tm 值，假如 Tm 值较低，则在 5’端加 GC使 Tm 值凑近 60 度（ primer express 软 件计算更正确） 。所以 miR-1 的上游引物可设计为： GCGCTGGAATGTAAAGAAGT。下游引物 是通用的，序列为 GTGCAGGGTCCGAGGT。引物设计好后，需要经过预试验 检测引物的特异性。 SYBR染料法一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性； 同时最 好将 PCR产物进行电泳检测产物能否单调（因产物长度很小，需要 3%以上的琼脂 糖胶）。 3）探针设计（ primer express）： TaqMan 探针地点尽可能凑近扩增引物 (扩增产物 50-150bp)，但不可以与引物重叠 。◆长度一般为 18-40mer（最好是 20-30bp） 。 ◆防止连续同样碱基的出现，特别是要防止GGGG或更多 G 出现。 ◆在引物的 5’端防止使用 G--由于 5G 会有淬灭作用， 并且即便是被切割下来还会 存在淬灭作用。可采纳比许多的碱基C。 ◆退火温度 Tm Tm 值在 65-70℃，往常 比引物 TM 值高 5-10℃（起码要 5℃）， GC 含量在 40%－70%。 实例参照： RT-PCR引物 及探针设计： Real-time quantification of microRNAs by stem–loop RT–PCR, Caifu Chen et al. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20 e179 Reverse transcrip