实验核酸酶的定点突变研究.pptVIP

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2021-11-03 发布于江苏
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实验核酸酶的定点突变研究.ppt

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文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！试验核酸酶定点突变研究一、试验目 1.经过本试验学习定点突变基础原理和试验技术。 2.熟练掌握PCR试验技术。二、试验原理经过设计引物, 并利用PCR将模板扩增出来, 然后去掉模板, 剩下来就是我们 PCR产物, 在PCR产物上就已经把这个点变过来了, 然后再转化, 筛选阳性克隆, 再测序确定就行了。定点突变原理图在本试验中我们以来自于Yersinia enterocolitica subsp.Palearctica 一个核酸酶（Y.NSN）基因为模板进行突变, 该核酸酶含有较高酶活, 然而来自于 Yersinia. enterocolitica subsp. Enterocolitica 8081 另外一个核酸酶则含有较低酶活, 所以, 经过氨基酸序列比对, 对两种核酸酶有差异氨基酸进行点突变, 来探究氨基酸残基对Y.NSN酶活影响。以下图所表示, 有15个位点氨基酸有差异, 在这里我们仅选择其中一处来进行突变方便来掌握定点突变技术。二、试验器材 1.菌种 DH5α感受态 2.材料 DNA模板（重组质粒pet24a）, PCR预混液, 引物对（正向引物和反向引物）, Dpn I（10U/ul）, 琼脂糖, GenStar 切胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒, 卡那霉素(50mg/ml), loading buffer, LB培养基 3.器材 PCR热循环仪, 琼脂糖凝胶电泳系统, 凝胶成像仪, 紫外分光光度计, 立式压力蒸汽灭菌器, 恒温培养箱, 恒温培养摇床, 电子天平, 电动离心机, 医用型洁净工作台。三、试验步骤 1. PCR反应（1）50ul反应体系 DNA模板 (质粒pet24a) 1ul 正向引物（10 uM） 1ul 反向引物（10 uM） 1ul 2×Pfu PCR StarMix 25ul ddH2O 22ul （2）反应条件: 95℃ 30sec 95℃ 30sec X℃ 1min(X为退火温度,由引物 Tm值决定) 72℃ 6min 72℃ 5min 4℃ 无限 2→4 反复15个循环文章如果有不当或者不妥的地方，请您联系我修改文章或者删除文章，文章来源于网络收集，如果有侵权的问题，请联系我沟通协调改正，非常感谢您！