实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法.pptVIP

实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法.ppt

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文章如果有不当或者不妥的地方,请您联系我修改文章或者删除文章,文章来源于网络收集,如果有侵权的问题,请联系我沟通协调改正,非常感谢您! 试验琼脂糖凝胶电泳一原理二目 掌握核酸电泳 方法 2、指示剂与染色剂 溴酚兰 二甲苯青 溴化乙锭 3、上样缓冲液(loading buffer,6*, 10*) 0.25%溴酚兰 0.25%二甲苯青 30% 甘油 溴化乙锭(Ethidium bromide, EB)是一个荧光染料, 这种扁平分子能够嵌入核酸双链 配对碱基之间, 在紫外激发下, 发出红色荧光。 激发荧光 能量来自两个方面, 一是核酸吸收波长为260nm 紫外线后将能量传给溴化乙锭, 二是结合在DNA分子中 EB本身, 关键吸收波长为300nm和360nm 紫外线 能量, 起源于这两方面 能量, 最终激发EB发射出波长为590nm 可见光谱红橙区 红色荧光。EB-DNA复合物中 EB发出 荧光, 比游离 凝胶中 EB本身发射 荧光强度大10倍, 所以不需要洗净背景就能够清楚地观察到核酸 电泳条带, 若核酸量少, 而EB 背景太深致使带型不清, 可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1小时或10mmol/LMgCl2中5min,使非结合 EB褪色, 降低未结合 EB产生 背景荧光, 这么能够检测到10ng DNA样品。 单链DNA,RNA分子中常存在本身配对 双链区, 也可嵌入EB分子, 但嵌入量少, 所以荧光较低, 其最低检出量为0.1ug. 本制品是核酸电泳用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/6量即可上样电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝(Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF(Xylene Cyanol FF), 能够观察电泳 进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶(0.5% ~ 1.4%)中约与300 bp 双链线状DNA 迁移速度相同(在0.5×TBE中), 而二甲苯腈蓝FF则与4 k bp 双链线状DNA 迁移速度相等。溴酚蓝与二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中 迁移速率则随凝胶浓度 改变而不一样。 本缓冲液配制组成合理, 缓冲液中不含核酸酶(DNase或RNase), 泳带清楚, 是试验室常见 凝胶电泳上样用缓冲液。通常来说, PCR反应后 琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳时, 常使用本制品。 (DNA用) 本制品是核酸电泳用Loading Buffer。制品中含有SDS, 可立刻停止多个酶促反应。使用时向酶促反应液中加入1/10量 本制品, 即可上样电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝(Bromophenol Blue), 能够观察电泳 进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶(0.5% ~ 1.4%)中约与300 bp 双链线状DNA 迁移速度相同(在0.5×TBE中)。 本缓冲液配制组成合理, 缓冲液中不含核酸酶(DNase或RNase), 尤其适适适用于多个酶促反应 停止以及多个酶促反应后 琼脂糖凝胶电泳。通常来说, 多个限制酶、修饰酶 酶促反应后电泳时, 常使用本制品。 (DNA用) 10×Loading Buffer (RNA电泳用) 组份浓度 配制量10 ml 配制方法 称量下列试剂, 置于10 ml离心管中。 2. 向离心管中加入约4 ml DEPC处理水后, 充足搅拌溶解。 3. 加入5 ml 甘油(Glycerol)后, 充足混匀。 4. 用DEPC处理水定容至10 ml后, 室温保留。 4、电泳缓冲液(10*) TAE TBE TPE 50×TAE Buffer(pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 称量下列试剂, 置于1 L烧杯中。 2. 向烧杯中加入约800 ml 去离子水, 充足搅拌溶解。 3. 加入57.1 ml 醋酸, 充足搅拌。 4. 加去离子水将溶液定容至1 L后, 室温保留。 10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 配制量 配制方法 10×MOPS Buffer 组份浓度200 mM MOPS, 20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 配制量1 L 配制方法 1. 称量41.8 g MOPS, 置于1 L烧杯中。 2. 加约700 ml DEPC处理水, 搅拌溶解。 3. 使用2 N NaOH调整pH值至

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