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细胞培养技术总结 细胞培养技术总结 PAGE 细胞培养技术总结 细胞培养技术总结 （ ， ， ， ） 1·培养环境的要求（切记无菌操作） 工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。? 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口? 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒。 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。? 2·仪器设备的要求 定期检测下列项目：? CO2 钢瓶之CO2 压力 。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。? 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 3·无菌处理 1）器具的无菌操作 试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： a玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 b胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 c塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。 2）消毒灭菌： a物理消毒法（紫外线，湿热，烘干，过滤）含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时? ?? ?? ?? ?? ?? b化学消毒法（70%酒精，千分之一的新洁尔灭） c抗生素：培养用液灭菌或预防培养物污染 3）无菌的操作技术 培养物的污染及控制 污染种类： （1）细菌污染：培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 （2）真菌污染：培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。 （3）支原体污染：培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 （4） 病毒污染：尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。 （5）非同种细胞污染： ?污染来源： （1）不洁的动物组织标本：正常情况下组织来源是不带菌的，但由于取材不小心也会染菌，也有可能动物体本身带菌，不用浓的抗生素清洗，会导致培养污染。 （2）空气：如果无菌操作区与外界隔离不严，空气中会带菌。其次，超净台使用过久，滤板堵塞也会污染。工作时不带口罩外界气流过强会污染。再者，南方空气潮湿，空气中容易带菌，操作不注意会染菌。 （3） 清洗消毒：培养用液除菌不彻底，培养器具清洗消毒不彻底。 （4）操作不过关 4试剂及器材的准备 1）培养基 1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine（谷氨酰胺） 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： . 细胞培养基通常