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高速逆流色谱操作 高速逆流色谱操作 高效逆流色谱方法整理 分离苯酚与间苯二酚（254nm） 1、配溶剂：正己烷:乙酸乙酯:无水乙醇 :超纯水=1:1:1.2:0.8（均为分析纯） 所有试剂都扩大400倍体积，分液漏斗：先加水、乙酸乙酯、正己烷、无水乙醇混匀，放气，静置，分层，针对本实验，上层作固定相，下层作流动相（水+乙醇作为下相）中间部分丢弃。用瓶子装好后超声脱气5～10min，不宜过长时间。 原理：萃取每1S 17次，分配系数K=0.5～2之间为宜。 2、预热检测器30min以上（时长7-4h），选好波长（6个，215～405nm），采集时间应尽量长，流动相应尽量多配。（压力max=2MPa、R=1000转、流速max=40mL/min、进样量=30～300mg，max=500mg） 样品预处理：只能用分离系统中的溶剂，一般用流动相溶） 3、泵满上相，作固定相 泵入固定相，白色接D打开，一端放入量筒中，调流速30～40mL/min，再按泵的power，再按run，当固定相流到白色接D处即泵满。再按stop，上相不流入转轴部分。 4、平衡（40～50min） 白色D接好，泵放入流动相，废液管放入量筒。调所需波长、吸光值、流速。（流速不高于3mL/min，一般1.5-2之间，否则固定相被冲出去。） 先开转轴部分的power，调转速为900转再按泵的run，看废液的分层or吸光度变化or基线的平衡来判断是否已达到平衡。 总体积=285mL柱体积+20mL进样器+10mL柱外=315mL 固定相保留率=总体积-固定相流出的量 100%（一般40%～50%即可）柱体积（285mL） 手动调节吸光度为0，按Load，再用针推进去气泡，进样管放入样品中，再用针拉以便进样。再按inject，再按电脑图谱中的绿色图标，即可记录图谱。测定完全后，再按红色按钮。 测定时有气泡：表示压力上升，解决用夹子夹住管，用反压阻止气泡进入分离系统（压力会上升，但不宜大于0.3～0.5 Mpa） 定量分析：20mL即可，用30mL定容样品，全注入，进样圈容量为20mL，另外剩下的样品用针拉出，丢弃。（样品浓度要已知） 若仍有物质残留，则将原本FWD（正相、正接正转）换成REV（反相、正相反转）即可。操作：先按泵stop，转轴完全停止后，先将泵放到相反相中在按REV。 6、关机（先关检测器、仍inject状态） （1）N2吹净：为防流动相流出，先关泵stop，再关转子的power。把泵从流动相中拿出，调流速40～30mL/min，再按泵的run，液体流到白色接D时，再按stop，白色接D拧开，开N2瓶，接D无花一端接到N2瓶的输出管中，废液流出。（气压不宜超过0.3Mpa，一般为0.1～0.2Mpa）关N2瓶。接回白色接D。 （2）95%乙醇or无水乙醇洗管 泵放入约100～150mL乙醇中，废液瓶不变，按run，流速40mL/min（约3～5min）后再按stop按钮。 （3）N2吹干 白色接D再拧开，泵拿出，接D无花一端接N2瓶，开N2瓶，干为手感无蒸气状即可（约30min）。 紫外：TP 540nm 黄酮 420nm 茶色素 380/460nm aa 570nm Caf 274nm 可溶糖 620nm