新冠病毒感染外周血中特异性免疫细胞亚型鉴定及其应用发明专利.docxVIP

新冠病毒感染外周血中特异性免疫细胞亚型鉴定及其应用 技术领域 本发明属于新型冠状病毒肺炎的诊断领域，特别涉及新冠病毒感染外周血中特异性免疫细胞亚型鉴定及其应用。 背景技术 对新冠状病毒(SARS-CoV-2)的感染诊断可以包括使用计算机断层扫描(CT) 诊断肺炎以及通过实时RT-PCR检测对咽喉拭子样本、下呼吸道分泌物、外周血或粪便中的病毒RNA(用SARS-CoV-2特异性引物和探针提取)。根据临床表现将COVID-19分为四型，既轻型，普通型，重型以及危重型，部分无临床表现但核酸检查的患者则被认为是无症状患者。由于缺乏针对SARS-CoV-2这种病毒的特异性药物，目前对这种疾病的临床治疗主要依靠支持性治疗来减少炎症反应和保持肺功能。当SARS-CoV-2与呼吸道上皮细胞结合后开始复制并向下迁移，随后进入到肺的肺泡上皮细胞开始大量的快速复制这一现象就可能引发一系列的强烈的免疫反应(细胞因子风暴)，近期有研究报道，与轻症COVID-19患者相比，重症患者血浆中IL2、IL6、IL7、IL10、GSCF、IP10、MCP1、MIP1A、TNFα的水平显著升高，因此表明炎性因子的大量释放是重症患者的一个显著特征。细胞因子风暴综合征可导致急性白细胞释放窘迫综合征和呼吸衰竭，这被认为是 COVID-19患者死亡的主要原因，年龄较大(60岁)和有严重既往疾病的患者发生急性呼吸窘迫综合征和死亡的风险更大。此外，重型COVID-19患者中免疫缺陷的比例也较高，这表明抗病毒的免疫能力不足也会导致感染。同时，淋巴细胞减少症，即血液中淋巴细胞(CD8+T,MAIT,γδT，NKT)数量减少，是重症COVID-19 患者免疫紊乱的另一个显著特征。目前的T细胞受体(TCR)跟踪分析显示， COVID-19患者肺组织中CD4+和CD8+T细胞的招募增强，诱导其局部制造细胞因子，可能导致细胞因子风暴和周围淋巴细胞减少。随后临床病理学也证实， COVID-19患者的组织病理学改变主要发生在肺部。组织病理学分析显示重症 COVID-19患者双侧弥漫性肺泡损伤、肺透明膜形成、肺细胞脱屑、肺纤维蛋白沉积。渗出性炎症在一些病例中也有表现。免疫组化检测在上呼吸道、细支气管上皮和粘膜下腺上皮，以及I型和II型肺细胞、肺泡巨噬细胞和肺透明膜中检测到SARS-CoV-2抗原。但目前，对于新冠病毒对人体免疫系统的具体影响还尚未明确。目前，没有能够治疗COVID-19的药物或抗SARS-CoV-2的抗病毒药物普遍被证明有效。目前COVID-19患者的疾病分型及预后主要通过临床表现症状(发热，咳嗽等呼吸道症状，呼吸速率，氧饱和率，氧合指数等)或实验室检查(基于流式细胞仪等的免疫细胞计数，细胞炎症因子含量检测等)判断，对于疾病进展及预后分析具有一定滞后性且缺乏针对COVID-19诊断的特异性方法，对快进展及多疾病基础的病人等，不能满足当前诊断及预判需要。目前单细胞RNA测序 (scRNA-seq)是新兴的可有效研究免疫机制的技术手段，基于10x Chromium Controller设备可具体精准分析个体单个细胞的转录表达谱，具有极高的特异性及灵敏度，已有多篇采用scRNA技术路线的相关研究提示存在COVID-19患者外周血单个核细胞细胞类群相对比例与抗病毒免疫对应关系，但目前仍缺乏同时覆盖不同临床症状人群的各类型细胞亚群的系统全面的细胞分析。 发明内容 本发明提供了一种类群细胞及其改造物在制备治疗新冠肺炎的细胞生物制品的用途，所述类群细胞为利用患者自身或同种异体或异种(非人类)的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在体外分离培养得到，所述类群细胞包括T细胞类群、DC细胞类群、B细胞类群中的任一种或多种；所述改造物是以所述类群细胞再经生物工程改造得到； 术语“在体外分离培养得到”，可具体分为：①直接分离培养：采集供者外周血，检测无污染后，生理盐水稀释，可通过Ficoll淋巴细胞分离液等试剂或血细胞分离机等设备制备获得外周血单个核细胞，利用无血清培养基调整细胞浓度，制成PBMC单细胞悬液，进一步根据特定目标细胞类群表面特征分子(示例： AIF1?+BCL2?+CD8?+初始T细胞通过T细胞表面特征分子CD3?+CD8?+AIF1?+BCL2?+进行细胞纯化)通过细胞流式仪等设备采集分选特定细胞并实现细胞分离纯化,纯化后细胞转移至细胞培养皿/瓶中，参考类群细胞所需体外培养条件(培养基，培养温度，培养二氧化碳浓度等)于体外进行细胞培养扩增，且此时可选择加入特定细胞类群生长分化所需细胞因子激活目标细胞(示例：AIF1?+BCL2?+CD8?+初始T细胞，采用无血清淋巴细胞完全培养基，加入IL-2等，细胞培养箱37℃，2-10％C