大肠杆菌基因工程课件.pptxVIP

大肠杆菌基因工程第一页，编辑于星期六：十九点 四十三分。大肠杆菌基因工程A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物第二页，编辑于星期六：十九点 四十三分。缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌基因工程A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势第三页，编辑于星期六：十九点 四十三分。大肠杆菌基因工程B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数第四页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子目的基因启动子最佳距离的探测EEA目的基因A 酶切开EE启动子Bal31酶解第五页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段终止密码子克隆到启动子探针质粒pKO1上AprpKO1galK受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，ori可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆第六页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子启动子的构建启动子-35 区序列-10 区序列PlLT T G A C AG A T A C TPrecAT T G A T AT A T A A TPtraAT A G A C AT A A T G TPtrpT T G A C AT T A A C TPlacT T T A C AT A T A A TPtacT T G A C AT A T A A TPtac = 3 Ptrp = 11 Plac第七页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子启动子的可控性基底水平转录乳糖启动子Plac的可控性：阻遏蛋白野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物PO乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）存在时，整个操纵子处于基诱导底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅高效转录提高PO第八页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性：cAMP高效转录CAP野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合PlacO区，cAMP激活CAP，CAP葡萄糖代谢cAMP浓度降低结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖基底水平转录代谢使cAMP减少，也能阻PlacO遏Plac介导的转录。因此，高效转录基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的Plac UV5O突变型，即Plac UV5第九页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子启动子的可控性色氨酸基底水平转录阻遏蛋白色氨酸启动子Ptrp的可控性：色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏PtrpOtrp蛋白复合物的阻遏，转录呈基底除去色氨酸或加3-吲哚丙烯酸 （IAA）状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），高效转录便可有效地解除阻遏抑制作用。PtrpOtrp在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程高效转录中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达PtrpOtrp第十页，编辑于星期六：十九点 四十三分。启动子启动子的可控性阻遏作用l噬菌体启动子PlL的可控性：目的基因cI857噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻PtrpPL遏，很难直接诱导控制。在基因AB工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导色氨酸表达目的基因的表达。但在大型细菌PtrpPL培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，AB用色氨酸间接控制目的基因表达第十一页，编辑于星期六：十九点 四十三分。终止子强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产