分离科学第七章制备色谱技术.pptVIP

常规柱色谱的操作 (1)装柱：干法和湿法； (2)上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可能窄； (3)洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，可梯度洗脱； (4)流分收集：常采用固定体积收集法，结合TLC检验； (5)样品回收：减压蒸馏或重结晶 第七章 制备色谱技术 第三十一页，共50页 7.2.3 干柱柱色谱 干吸附剂，待分离样品配成浓溶液或吸附于少量填料上上样，洗脱液接近色谱柱底部时停止洗脱，挖出或切开色带。 第七章 制备色谱技术 时间短 节省试剂 玻璃柱 尼龙柱 第三十二页，共50页 7.2.4 减压柱色谱 减压促进溶剂流动。 第七章 制备色谱技术 第三十三页，共50页 与加压相比，变换溶剂更加方便； 吸附剂高度一般不超过5cm； 分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶剂的比例，开始阶段增加幅度较小(1%,2%,3%)，随后幅度逐步增大(5%,10%,20%等)，通常收集20-25个流分即可将所有成分洗脱。 第七章 制备色谱技术 第三十四页，共50页 7.3 加压液相柱色谱技术 (1)快速色谱法：约0.2MPa； (2)低压液相色谱法：0.5MPa； (3)中压液相色谱法：0.5～2MPa； (4)高压液相色谱法：2MPa； 第七章 制备色谱技术 第三十五页，共50页 第一页，共50页 第七章 制备色谱技术 7.1 制备薄层色谱法 7.1.1特点 设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高； 切割谱带更加方便； 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。 第二页，共50页 第七章 制备色谱技术 7.1.2 常规制备薄层色谱PTLC 薄层板制备 为了增大上样量，增加了吸附剂用量。 固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、C2、C18等反相健合硅胶 支撑：玻璃板或铝箔 平均25?m, 5~40 ?m 硅胶H、硅胶G、硅胶F254、硅胶F365、硅胶P 第三页，共50页 第七章 制备色谱技术 硅胶粒径范围影响： 越细越均匀，分离度越高，但？ 粒径范围宽，分离效率低，怎么办？ ------薄层厚度的渐变 薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富集，可保持较窄的谱带。 第四页，共50页 第七章 制备色谱技术 薄层板的制作方法： 常采用湿法：平铺法和涂铺法。 混合 平铺 涂铺器 自然干燥一夜 105-120℃活化 黏合剂 硅胶 煅石膏 或羧甲基纤维素钠水溶液 第五页，共50页 第七章 制备色谱技术 薄层色谱条件选择 操作参数 流速 展开模式 分离距离 样品量 流动相 选择性 溶剂强度 黏度 展开缸类型 薄层板和展开缸空腔体积比值 温度 蒸气相 固定相 薄层厚度 颗粒大小 质量 开放型 操作不连续 第六页，共50页 常用溶剂 (1)电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等； (2)质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙醇等； (3)强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等； (4)质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等； (5)偶极作用溶剂：二氯甲烷 (6)惰性溶剂：环己烷、正己烷等。 第七章 制备色谱技术 第七页，共50页 第七章 制备色谱技术 上样和展开 先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质； 低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶剂极性尽可能小。 样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜，5-10%； 带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方2cm处进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。？ 第八页，共50页 第七章 制备色谱技术 样品检测 有色物质直接观察斑点； 荧光物质在紫外灯下观察； 无色无荧光可在荧光板分离，紫外光下显示暗斑； 喷显色剂，结构稳定且不易氧化物质可以用碘蒸气显色，可逆； 第九页，共50页 第七章 制备色谱技术 常用显色剂： 硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，喷后110℃烤5分钟，不同有机物显不同的颜色； 0.05%高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，背景淡红色； 酸性重铬酸钾：5%重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150℃烤薄层； 5%磷钼酸乙醇溶液：喷后120℃烤，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。 第十页，共50页 第七章 制备色谱技术 样品收集： 切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器； 回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1g吸附剂用5mL溶剂，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。 4型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用0.2-0.45?m滤膜过滤。 硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可用Sephadex LH-20过滤纯化。 第十一页，共50