文本形态学实验3月14日.pptxVIP

荧光显微镜的成像原理与使用;一、荧光显微镜; 荧光显微镜的成像原理;荧光显微镜的成像原理;物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光：物质吸收短波光，发射出的长波光。 ;保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度;自发荧光 二次荧光;优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析;荧光显微镜的分类;透射式荧光显微镜 落射式荧光显微镜 ;荧光素的特性;荧光显微镜使用方法;使用注意事项;二、荧光显微镜技术;荧光素直接标记技术 免疫荧光技术（直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术） 荧光原位杂交技术（荧光素直接标记探针） ;间接免疫荧光技术原理;间接免疫荧光实验过程;荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用;FITC+Texas Red+DAPI;双重染色标本的单色和双色观察;三、激光共聚焦显微镜;激光扫描共聚焦显微镜; 普通荧光显微镜的不足 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（D=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。;共聚焦扫描显微镜的成像原理 采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦???照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。;每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。;Confocal Principle;观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光、近红外） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测, 数字化图像，可以进行图像处理和定量分析 多重染色样品的观察 高分辨率 普通显微镜 0.61λ/NA 共聚焦显微镜 0.55λ/NA ;共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用 细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等 细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术） 细胞内氧自由基活性 细胞内钙离子浓度变化 膜电位; Feulgen反应的基本原理： 稀HCl水解DNA，破坏嘌呤和脱氧核糖间的配糖键，并在脱氧核糖C1端形成游离的醛基，Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。;实验步骤:;血涂片：;;注意事项;吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密