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实验四;克隆程序简图;【实验目的】; 已有20余种原始或衍生的方法可供选择，但缺乏高效回收不同大小DNA的普遍实用方法; ;低融点琼脂糖法凝胶制备;回收方法的选择;产物的纯度
未达标则严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应
产物的回收率
否则增大前期工作量;玻璃纤维柱法快速回收DNA片段;1、电泳分离目的片段(电泳);酶切样品：每人的酶切样品上一个样品孔(大点样孔) 50μl(或74μl)＋9μl 10 ?上样缓冲液,混匀,Short,上样
DNA marker：5μl DSTM5000 (小点样孔)
A1,B1 (50μl样品)回收pET28a中的4.7 kb片段
A2,B2 (74μl样品)回收pEGFP-N3的0.7 kb片段;2、目的片段凝胶的回收(切胶);溶胶:估计凝胶的体积,按照100μl胶加入500μl的溶胶液(Gel-lysis Buffer 溶胶液,6M NaI)65℃水浴溶胶,其间偶尔摇动,至胶完全溶解(熔胶要充分);装柱: 将溶液冷却至室温,装柱(做标记),10000rpm离心30秒,滤液可以重新上柱,重复离心一次后弃滤液;漂洗：500μL漂洗液(Washing Buffer漂洗液,含75%乙醇)漂洗,12000rpm离心30秒,去掉废液
重复漂洗：重复漂洗一次,弃废液
干燥：再12000rpm离心2min(离心要充分,彻底去除乙醇) ;洗脱:在柱子中央加入120μl洗脱缓冲液(elution buffer)或ddH2O,室温放置2分钟,转入新的EP管中(标记),12000rpm离心1分钟,收集滤液
沉淀:向滤液中加入15μl的3MNaAC溶液,混匀,然后再加入270μl的无水乙醇,-20℃保存备用(下次实验材料);2人一块胶
两人一组
分别回收载体及目的片段;进行回收电泳时，往往需要在紫外灯下监测。注意应使用长波紫外灯。因为短波紫外线（254nm）会引起DNA链断裂，或是造成基因突变
所有与回收片段接触的试剂及器皿等都应进行灭菌处理，防止DNA酶的污染
回收时的操作要轻柔，特别是大片段，防止机械剪切力对DNA的破坏;【技术关键】;实验五 DNA重组(连接反应)
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