第十二章-固相膜免疫测定PPT课件.pptVIP

2021 第十二 第十二章　固相膜免疫测定 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。 　第一节 概述 标记免疫测定 放射免疫测定 　 1960’ 酶免疫测定 　　 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 膜固相免疫测定 1990’－ 一、免疫测定分类 免疫浊度测定 Ag + Ab AgAb + Ab 标记免疫测定 Ag + Ab* Ag Ab* + Ab* （B） （F） 二、免疫测定原理 利用抗原抗体反应检测标本中微量物质 　抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag +Ab 　Ag * Ab 三、固相免疫测定 B与F分离 Ab* Ab* Ag + Ag + Ab* Ab Ab 四、固相膜的特点 多孔性 毛细管作用 非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作简便 五、常用的固相膜 玻璃纤维素(fiberglass)膜 尼龙(nylon)膜 聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜 六、固相膜的技术要求 孔径：0.2~0.6 μm 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示 均一性 第二节　免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。 一、胶体金制备 　胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。 胶体金的制备及特性 胶体金粒径 1%柠檬酸钠加入量 胶体金特性 （nm) （ml)* 呈色 lmax(nm) 16 2.00 橙色 518 24.5 1.50 橙红色 522 41 1.00 红色 525 71.5 0.70 紫色 535 *还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量 胶 体 金（Colloidal Gold）15~60 nm 优 质 劣 质 胶体金结合物（Conjugate） 膜固相免疫测定的特点 第三节　膜载体免疫测定的种类与原理 优点 不足之处 简便，快速 敏感度略低，价格略高（与ELISA比） 单份测定 精密度较差，质控困难 保存期长（优质试剂） 稳定性较差（普通试剂） 可测定物范围广（主要为定性试验） 不易制备定量、半定量试剂 感染性疾病的诊断 妊娠、排卵的诊断 肿瘤标志 心肌标志 滥用药物 固相微孔膜测定种类 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA） 斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT) 放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 一、免疫渗滤测定(IFA) IFA——双抗体夹心法测抗原 A B IFA——结果判断 二、免疫层析测定（ ICA ） ICA 试剂条 样 品 垫 结 合 物 垫 NC 膜 吸 水 垫 ICA——双抗体夹心法测抗原 ICA——间接法测抗体 ICA 结果观察 阳性 阴性 无效 IFA与ICA的比较 IFA ICA 试剂形式 渗滤装置及附加试剂 试剂条 试剂保存 4~8℃ 6个月 室温一