高中生物竞赛：常用分子生物学技术的原理及应用课件.pptVIP

核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)略 DNA链的末端合成终止法 (Sanger法) * (Sanger双脱氧链终止法) HO P O P O P O CH2 O O O OH OH OH O A, C, G or T 1′ 3 ′ OH α β γ 5 ′ 双脱氧核苷三磷酸 脱去 一、DNA链末端合成终止法 Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖 * * * The Nobel Prize in Chemistry 1980 for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Paul Berg Walter Gilbert Frederick Sanger 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize Stanford University Stanford, CA, USA Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USA MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 1926- 1932- 1918- * 二、DNA自动测序 用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。 通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 * 目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记，平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记 毛细管电泳 单色荧光标记 平板电泳 同位素标记 平板电泳 A C G T A C G T * * Section 4基因工程 * 第一节 分子克隆载体与宿主 分子克隆载体(vector)是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子 * 质粒载体（ Plasmid vectors ） 质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双链DNA分子 (1~500 kb) pBR322 * λ载体（ Lambda vector ） λ噬菌体的基因组 ◇ 48514 bp，线状双链DNA ◇ 线状分子两端具有12 n.t的5’-端突起的可互补的粘性末端（cohensive end，cos），该末端称为cos位点，可被λ编码的A蛋白所识别 ◇ 当λ侵入宿主细胞后，线装DNA分子借助粘性末端连接成环状分子 * λDNA cos位点 cos位点 * * Yeast Artificial Chromosome (YAC) 酵母人工染色体 Carry 1~2 Mb DNA 1Mb = 1,000,000 bp 克隆片段大小约1Mb * 分子克隆载体的功能: 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞的复制或整合能力 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力 * 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 至少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA插入 具有较小的分子量和较高的拷贝数 具有对受体细胞的可转移性，提高载体导入受体细胞的效率 * 标记基因的作用： 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子 * 标记基因的种类： 抗性标记基因 营养标记基因 生化标记基因 * * 常用的遗传标记基因 四环素抗性基因（Tcr） 氨苄青霉素抗性基因（Apr） 氯霉素抗性基因（Cmr） 卡那霉素(Kanr)、 新霉素(Neor)、G418抗性基因(G418r) * β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） ◇ β—半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 ◇ 其氨基末端称为α链，羧基末端称为β链 ◇ α链负责将β链装配为四聚体