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基因工程期末复习 第一章：基因工程 1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动 称为基因工程。 2. 基因工程研究的主要内容或步骤： 基因克隆的通用策略 ：涉及的过程可用分 /合成、切、连、转、选、鉴。 ①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因 的 DNA 片段； ②在体外， 将带有目的基因的外源 DNA 片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体 分子上，形成重组 DNA 分子； ③将重组 DNA 分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞） ，并与之一起增殖； ④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组 DNA 分子的受体细胞克隆； ⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用； ⑥将目的基因克隆到表达载体上， 导入寄主细胞， 使之在新的遗传背景下实现功能表达， 产 生出人类所需要的物质。 3.三大元件：载体、质粒、片段。 第二章：分子克隆工具酶 1、工具酶：限制性核酸内切酶、 DNA 连接酶、 DNA 聚合酶、 DNA 修饰酶、核酸外切酶、 单链核酸内切酶。 2、限制性内切酶：是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核苷酸内切酶。三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶） 3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不 被相应的限制酶所切割。三种（） 4、回文结构：双链 DNA 中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每 条单链以任一方向阅读时都是一样的。 5、同裂酶（ isoschizomers) ：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶可能进行 同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 6 、同尾酶（ isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内 切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 7、影响核酸内切酶活性的因素：① DNA 浓度② DNA 的甲基化程度③酶切消化反应的温度 （大多数酶的标准反应温度 37 度）④ DNA 的分子结构。 星星活性： 在极端非标准条件下， 限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊 性称为星星活性（ star activity) 。 8、Ｔ 4 连接酶：该酶常从Ｔ 4 噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ 4 噬菌体基因组所编码的， 所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ 4 连接酶。 9、影响连接酶作用的因素 ①反应温度：连接缺口的温度： 37 ℃；连接粘性末端的最佳温度： 4～ 15 ℃。 ②Ｔ 4DNA 连接酶的用量：平末端 DNA 分子的连接反应中，最适 1～2 个单位。粘性末端 DNA 片断之间的连接，酶浓度 0.1 个单位。 ATP 的用量 10 μmol~1mmol/L 之间。 ③提高外源片断与载体的浓度的比值， （10～20 倍）。 10、常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法。 11、DNA 聚合酶： DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、 dNTP 等的情况下） 及其相辅的活性。 依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶： DNA 聚合酶Ⅰ (全酶 )；DNA 聚合酶Ⅰ大片段 (klenow 片段 ) ；耐热 DNA 聚合酶 (Taq 酶 ) ；依赖于 RNA