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水稻原生质体制备及转化方法 水稻原生质体制备及转化方法 PAGE 水稻原生质体制备及转化方法 原生质体制备及转化 1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。 2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。 3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约 mm的小段。 4.将小片段立刻放进 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。 5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（% Cellulase RS，% Macerozyme R-10， M甘露醇，的10mM MES，10mM CaCl2，% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。 6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 的2mM MES）。用手充分摇晃10s。 7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。 离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。 9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清 10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清 11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl 原生质体 12.分装2 mL离心管，每100μl 原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀 ℃避光静置转化20--25min 14.加 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。 15.重复步骤14 16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时 17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液 18.共聚焦显微镜观察拍照 配制溶液方法： I：配成母液 试剂名称 MW 母液浓度 质量 配制体积 甘露醇（D-Mannitol） M 500mL CaCl2 1 M 50mL BSA 2% 20mL KCl M 50mL MES M 50mL MgCl2·6H2O 50mL PEG4000 现配(W/V) 酶液 试剂 10mL 30mL 终浓度 Cellulase RS % Macerozyme R-10 % D-Mannitol MES 1mL 3mL 10mM CaCl2 10mM BSA(2%) % 加ddH2O补足 10mL(~ 30mL(~ W5溶液 试剂 60mL 100mL 终浓度 NaCl % CaCl2 125mM KCl 3mL 5mL 5mM MES 2mL 2mM 加ddH2O补足 60mL(~ 100mL(~85mL) MMG溶液 试剂 5mL 50mL 终浓度 D-Mannitol 25mL MgCl2 15mM MES 2mL 4mM 加ddH2O补足 5mL(~ 50mL(~ PEG(5mL) 试剂 5mL 10mL 终浓度 PEG4000 2g 4g 40%(W/V) D-Mannitol CaCl2 1mL 加ddH2O补足 5ml(~ 10mL(~