动物细胞制药.ppt

第六章 动物细胞工程制药 ;一、动物细胞的形态 通常将离体培养的细胞分为贴壁细胞、悬浮细胞、兼性贴壁细胞。 1、贴壁细胞：细胞的生长必须有给以贴附的支持物表面，细 胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面生长、增殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态：成纤维样细胞型、上皮样细胞型。 2、悬浮细胞：细胞的生长不依赖于支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。如血液中的淋巴细胞。 3、兼性贴壁细胞：有些细胞的生长不严格地以来于支持物，它既可以贴附??支持物表面上生长，也可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长。;二、动物细胞细胞的生理特点 1、细胞的分裂周期长：一般需要12-48h，随不同的种属不同而不同。 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。细胞生长需要于基质上贴附，伸展后才能生长繁殖。 3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。随着年龄增大而细胞的培养代数会减少。 4、对周围的环境十分敏感。 5、对培养基的要求高：需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖、多种细胞生长因子、贴壁因子等才能生长。 6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 ;第二节 生产用动物细胞的获得 一、生产用动物细胞的获得 什么样的细胞才能允许用以生产人用的药品，这一直是一个引起人们争论的热点。 用于生产的动物细胞有：原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限期传代的转化细胞系、以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。 1、原代细胞：直接取动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 ;二倍体细胞株仍具有正常细胞的特点： A、2n染色体核型 B、具有明显的贴壁依赖和接触抑制 C、只有有限的增殖能力、一般可连续传代培养50代。 D、无致瘤性 3、转化细胞系：是通过某个转化过程形成的，常常由于染色体的断裂变成了异倍体，而失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力。;二、基因工程细胞的构建和筛选 1、真核细胞基因表达载体的构建 目前一般选择的载体有： （1）病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒等。 牛痘病毒：构建多价疫苗； 腺病毒、反转录病毒：用于基因治疗； 杆状病毒：作载体用于外源基因表达。 杆状病毒作为载体的优点： ①是双DNA，易于重组； ②插入7-8个bp的DNA不会影响正常病毒粒子的形成； ③多角体蛋白质和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子； ④多角体蛋白基因有强启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20-30%； ⑤用显微镜可以看到多角体，可以此为标记物来挑选阳性克隆； ⑥如果用家蚕杆状病毒，可以在家蚕体内直接表达外源基因。;（2）质粒载体 常用穿梭质粒载体：能在细菌和哺乳动物细胞内都能扩增。;高效表达工程细胞株的筛选： ① 依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统：HAT选择系统：筛选tk+、hgprt+的转化细胞；G418（geneticin）选择系统：筛选neor的转化细胞；MTX选择系统：筛选dhfr+的转化细胞。 ② 对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化 ③ 在多数情况下要利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数，从而获得能高效表达的稳定的工程细胞株。;四、细胞库的建立 除原代细胞外，其他的细胞株、细胞系，无论是二倍体细胞、转化细胞、融合细胞还是经重组的工程细胞，一旦建立后都要建立细胞库加以保存。按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立2个细胞库： （1）原始细胞库（master cell bank,MCB）； （2）生产用细胞库（manufacturer’s working cell bank ,MWCB）或叫工作细胞库（working cell bank ,WCB）。;贮藏细胞的档案资料： ① 细胞系历史：来源、动物的年龄、性别、细胞分离方法、所用培养材料（来源于人的还需该人的病史） ② 细胞的特性： 形态、生长特性—增倍时间、分种批；种源的特性：核型、同功酶、细胞抗原、特异的标记染色体；用于生产用的重组细胞：载体构建的资料、基因拷贝数、表达产物的性质、产量及其稳定