F9基因无义突变导致重型血友病的分子机制.pdfVIP

F9 基因无义突变导致重型血友病的分子机制 【摘要】：血友病是一种 X 染色体连锁的隐性遗传性疾病 ,是由编码凝 血因子的基因 (F8 和 F9)突变导致的先天性凝血机制障碍的疾病。在 血友病患者中大约有 80%为重型患者 ,重型血友病患者的凝血因子的 功能活性小于正常值的 1%,频繁性的出血不止使得患者常伴有严重 的关节病或早期死亡。只要将凝血因子的活性提高到 5%就可以使重 型血友病患者的症状得到明显改善。由于凝血因子Ⅸ (F9)的活性中心 位于最后 2 个外显子上 ,无义突变使得翻译提前终止 ,往往造成了重型 血友病患者。 根据血友病数据库中登记的点突变类型 ,发现在 F9 基因 的突变中 ,无义突变占了 11.1%。为了阐明 F9 基因无义突变导致重型 血友病的分子机制、哺乳动物细胞 NMD 途径和 NAS 途径机制 ,为无 义突变导致遗传性疾病的治疗提供理论基础 ,本研究以 F9基因为研究 对象 ,对其不同位置发生无义突变后的分子生物学现象进行分析 ,获得 如下结果：1.构建了人凝血因子Ⅸ小基因 Mini-hF9, 该基因包括 3 个部 分 ,分别为：外显子 1+部分内含子 1(673bp)、部分内含子 5+外显子 6+ 部分内含子 6(2115bp)、部分内含子 6+外显子 7+ 内含子 7+外显子 8(1553bp) 。 构 建 了 含 有 Mini-hF9 基 因 的 重 组 表 达 质 粒 pCMV-MH-Mini-hF9, 并 将 其 转 染 到 细 胞 中 , 通 过 RT-PCR 及 WesternBlot 分析发现 ,小基因可以正确剪接并表达全长蛋白。 2.根据 血友病数据库中登记的点突变类型 ,设计并构建了 5 个无义突变体： El(nt95TAinExon1) 、 E7a(nt34GTinExon7) 、 E7b(nt85GTinExon7) 、 E7c(nt52GTinExon7)和 E8(nt42CTinExon8)。通过 RT-PCR分析发现在 无义突变体 E7a、E7b、E7c 中除了产生正常的剪接体 NormmRNA 外, 还产生了 2 个选择性剪接体 Alt-S1mRNA 和 Alt-S2mRNA; 通过 WesternBlot 检测发现无义突变 E7a、E7c 中截短型蛋白 ( 由于无义突 变导致蛋白质翻译提前终止而产生截短型蛋白 ) 的表达量较低。 3.qRT-PCR 分析 Mini-hF9 基因及其无义突变体中 NormmRNA 水平 , 发现 E7a 和 E7c 中 NormmRNA 水平明显降低 ,而 El 、E7b、E8 三个 无义突变体中 NormmRNA 水平与 WT 野生型相比没有明显变化 , 由此 推断 E7a 和 E7c 中可能发生 NMD 途径来降解 NormmRNA 。通过 CHX( 放线菌酮 )处理实验发现 ,在使用 CHX 处理细胞 (CHX