PLFA的提取和鉴定.pdfVIP

PLFA 的提取和鉴定 实验原理和目的 PLFA 原理 磷脂脂肪酸(PLFA)是活体微生物细胞膜的重要组分, 不同类群的微生物可通过不同的 生化途径合成不同的PLFA。一些PLFA 可作为分析微生物量和微生物群落结构变化的“生 物标记”。 传统上微生物多样性研究多依赖于培养方法和显微技术,即采用选择性培养基从样品中 分离出纯菌株后进行鉴定,获得可培养微生物的种类和数量信息。但该方法存在以下缺点:(1) 许多微生物是不可培养的,分离鉴定到的微生物只占微生物总数很少一部分，因此,通过该传 统方法只能得到微生物群落信息的极小部分(2)只能了解可培养的极少数微生物数量和群落 结构,具有选择性且不能对大多数微生物定量研究(3)对于微生物群体相互作用研究的贡献很 小。目前,磷脂脂肪酸(PLFA)分析被广泛地应用于微生物多样性研究。磷脂是所有生物活细 胞重要的膜组分,在真核生物和细菌的膜中磷脂分别占约50%和98% 。PLFA 是磷脂的构成成 分,它具有结构多样性和生物特异性, PLFA 的存在及其丰度可揭示特定生物或生物种群的存 在及其丰度。磷脂在细胞死亡后快速降解(厌氧条件下约需2 d,而好氧条件下约需12～16 d)。 故用以表征微生物群落中“存活”的那部分群体。 总之,通过对 PLFA 的定量测定可完成对了解微生物活细胞生物量的测定。通过根据 PLFA 分析的种类了解土壤、肠态微生物群落结构。 实验步骤 样品的采集和预处理 实验所需仪器和试剂： 聚四氟乙烯试管，涡旋器，玻璃试管，马弗炉两个，烧杯 正己烷 1.用2-3 毫升正己烷清洗聚四氟乙烯试管，（清洗时需涡旋震动），再将它们放入马弗炉里干 燥，玻璃试管处理同上（每6 支试管换液一次） 2.将采集的粪样放入聚四氟乙烯管中进行液氮处理，干燥 3.磨碎样品混匀，置于-20 摄氏度的冰箱中。 第一天 所需药品与器材：震荡器，离心机，移液管，玻璃试管，抽吸器，氯仿，磷缓冲液，甲醇， 沙子， 1.将50 支试管分为5 组编号A-E ，每组10 支编号1-10，并做如下处理（准确称量）： 试管号 A B C D E 质量（g) 组号 1 0.5 1 1.5 2 2.5 2 0.5 1 1.5 2 2.5 2.在通风环境下将3.6 mL 的磷缓冲液，4mL 的氯仿和8mL 的甲醇分别加入试管中（需3 个5-10mL 的移液管） 3.在避光的条件下，震荡1 个小时，用最大功率。注意避光保存 4.离心分离，调整转速在3000 rpm，30 分钟（注意平衡试管的质量） 5.在通风环境下，将离心后上清液转移到对应标号的新试管中，避免混淆 6.将3.6ml 磷缓冲液和4ml 的氯仿加入对应新试管中 7.震动1 分钟（平衡气压） 8.放入-20 摄氏度冰箱里避光保存。 第二天 所需药品器材：同第一天 1.在通风环境下，吸取上层三分之二出的液体（使用真空抽吸器），保留氯仿层（保证无水） 2.用氮气吹干氯仿层，尽可能的避光，可以适当加热促进挥发，但温度不能超过30 摄氏度 注意事项：在操作过程中尽量避免样品与氧气的接触 第三天 所需药品与器材：氯仿，甲醇，氮气源，滴瓶，玻璃试管，0.5ml 玻璃移液管，沙子 1.移液：向提取后的液体中加入2ml 氯仿，移入干净的试管中 （1）使用移液器，吸取0.5ml 样液，用于清洗移液器，重复2-3 次； （2 ）使用清洗后的移液器，吸取0.5ml 的样液，直接加入样品管的底部，注意使用过程中 移液器一定避免污染； （3 ）用涡旋的方法去除残留的脂肪酸；使用新的移液器，除去样品中的脂质，置于已标记 的新的样品管中，保护好移液管； （4 ）重复（2 ）-(3)过程 3-4 次至移液总量达两毫升（如果样品呈乳浊状，加入甲醇吸水， 直至澄清，用量约0.5ml ） （5 ）在最后一次转移后，清洗移液管，切换样品时要清洗移液管 （6 ）干燥所有样品，可沙浴加热 注意保证样品的纯净，氮气低温，避光，储存 第四天 所需药品与器材：SPE 层析柱，水槽，15ml 的试管，沙子，氮气源，0.5