南农 生物分离工程 生物分离7 亲和.pptVIP

亲和层析;生物亲和作用; 生物亲和作用的本质;4;配基固定化、吸附样品、样品解吸 “亲和吸附剂”：载体与固定化配基的总称;具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键 ; 亲和作用体系 ;常用的亲和作用体系 特异性 亲和作用体系 高特异性 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 群特异性 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）; 亲和色谱 ; 亲和色谱填料; 亲和配基;配基的浓度 亲和势较低（ KL ≥ 10-4mol/L），增加配基浓度或增加柱长 大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖， 吸附强，非专一性吸附↑ 理想配基浓度1-10μmol/L，2 μmol/L凝胶 配基分子大小 首选大分子或插入“手臂” ;偶联位置 e结合有效，偶联位置导致 亲和力差异，可吸附不同配体 ;亲和配基 1. 酶的抑制剂 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。 底物，亲和力＜抑制剂，专一性较差， 转变为产物，用不适pH，缺少辅因子 辅酶：专一性不强 ;2. 抗体;3. A蛋白 protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。 A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。;4. 凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的???称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。 pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。 在利用con A为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。;5. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP（adenosine 5-monophosphate）、 ADP（adenosine 2，5-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。;6. 三嗪类色素 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligand affinity chromatography）。 Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、 干扰素、核酸酶和糖解酶 等具有很高的亲和力。 Cibacron Blue F3GA ： ;7. 过渡金属离子 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。 这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合色谱（metal chelate chromatography）或固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal