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可溶性蛋白质含量的测定 可溶性蛋白质含量的测定 PAGE / NUMPAGES 可溶性蛋白质含量的测定 . 植物体内可溶性蛋白质含量的测定 植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标， 如在研究每一种 酶的作用时常以比活 (酶活力单位／毫克蛋白质， unIT ／Mg ProTeIn)表示酶活力 大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。常用的测定方法有 LoWry 法和 考马斯亮蓝 G－ 250 染色法，本实验将分别介绍这两种方法。 方法一： LoWry 法(劳里法 ) 【原理】 LoWry 法是双缩脲法 (BIureT)和福林酚法 (Ｆ olIn－酚 )的结合与发展。其原理是蛋 白质溶液用碱性铜溶液处理后， 碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反 应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的 蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸 (PHosPHoMolyBdATe ＆ PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混 合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关， 所以可以用于蛋白质含量的 测定。LoWry 法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外， 还使双缩脲法 中肽键的显色效果更强烈， 其显色效果比单独使用酚试剂强 3～15 倍，约是双缩 脲法的 100 倍。由于肽键显色效果增强， 从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏 差。LoWry 法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。 但对不溶性 蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理 (如加入少量的 SDS)。 精品 . 1.双缩脲法的原理双缩脲 (NH2-CO-NH-CO-NH2) 在碱性溶液中可与铜离子产生 紫红色的络合物， 这一反应称为双缩脲反应。 因为蛋白质中有多个肽键， 也能与 铜离子发生双缩脲反应， 且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比 尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关， 所以可用双缩脲法测定蛋白质 的含量。 双缩脲反应主要涉及肽键， 因此受蛋白质特异性影响较小。 且使用试剂价廉易得， 操作简便，可测定的范围为 1～10Mg 蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含 量的测定，能测出的蛋白质含量须在约 0 5Mg 以上。双缩脲法的缺点是灵敏度 差、所需样品量大。 干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液， 如 TrIs 缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色 沉淀。 2.福林 -酚法的原理 该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应： (1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸 (Ｆ olIn 试剂 )还原，混合物深蓝色 (磷钼蓝和磷 钨蓝混合物 )，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩 脲法高 100 倍，定量范围为 5～ 100 μg蛋白质。 Ｆ olIn 试剂显色反应由酪氨酸、 色 氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰 作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响， 即不同蛋白质因络氨酸、 色氨酸 含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。 精品 . 【仪器与用具】 试管若干；刻度移液管 0 5Ml 1 支， 1Ml 1 支，10Ml 1 支；定量加样器；圆底烧 瓶；冷凝管 1 套(带橡胶管 )；微量滴定管；小烧杯；微量进样器 50 μ l 支1； 721 分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。 【试剂】 NA2WO4· 2H2O； NA2MoO4· 2H2O； 85％ H3PO4；浓 HCl； LI2SO4 · H2O； 溴水；酚酞指示剂； NA2CO3；NAOH ； CuSO4· 5H2O；酒石酸钾钠；牛血清 白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。 【方法】 试剂的配制 (1)碱性铜试剂 (相当于双缩脲试剂 )的制备首先配制 A 液： 4％碳酸钠 (NA2CO3)溶 液与 0 2Mol／L 氢氧化钠 (NAOH) 溶液等比例混合 (2％ NA2CO3 ，0 1Mol NAOH) ；B 液： 1％硫酸铜 (CuSO4 · 5H2O) 溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混 合 (0 5％ CuSO4· 5H2O，0.1％酒石酸钾钠 )。在使用前将 A 液与 B 液按 50∶1 的比例混合即成。此为Ｆ olIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用 1 天。 酚试剂 (相当于Ｆ olIn 试剂 )的配备：称取钨酸钠 (NA2WO4· 2H2O)100g 、钼酸钠 (NA2MoO4· 2H2O)25g ，加蒸馏水700Ml 溶解于 1500Ml 的圆底烧瓶中。之后加 入 85％的 H3PO450Ml，浓 H