可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法).docVIP

可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法) 可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法) PAGE / NUMPAGES 可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法) . 可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法） 试剂配制 1）考马斯亮蓝溶液配制： 称取 100 mg 考马斯亮蓝， 溶于 50ml 90%乙醇中，加入 100ml 85% W/V ）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个 月。 90% 乙醇配制： 95%乙醇和 75%乙醇按 3:1 体积比混合配制，即 95%乙醇 37.5ml， 75%乙醇 12.5ml 或取 45ml 无水乙醇直接定容至 50ml。 （2） 100 g/ml 牛血清蛋白（ BSA）标准溶液：称取 10mg BSA定容至 100 ml 即为 100 g/ml 。 或称取 25 mg BSA 加蒸馏水水溶解后定容至 100 ml，再从中吸取 40 ml 蒸馏水定容至 100ml。 （3） 0.05 mol/L ，pH7.8 磷酸配制： A 母液， 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na 2HPO 4 12H2O (分子量 358.14)35.85 g，用蒸馏水 定容至 500 ml。 B 母液， 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH 2 PO4 2H2O ( 分子量 156.01)1.5601 g，用蒸馏水 定容到 50 ml。 0.05M pH7.8 磷酸：分别取 A 母液 228.75ml， B 母液 21.25ml，用蒸馏水定容至 1000ml。 2. 标准曲线绘制 取 6 支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入 5ml 考马斯亮蓝试剂， 5min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595nm 下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标， 以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 试剂 0 号 1 号 2 号 3 号 4 号 5 号 标准蛋白体积 /ml 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水体积 /ml 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 蛋白质含量 / g 0 20 40 60 80 100 样品测定 （1） 样品提取： 取鲜样 0.2— 0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后， 3000r/min —4000r/min 离心 10min，上清液备用。 （2） 吸取样品提取液 1.0ml（视蛋白质含量适当稀释） ，放入试管中（每个样品重复两次） ， 加入 5ml 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2min 带反应完成，在 595nm 下比色，测定吸光度， 并通过标准曲线查蛋白质含量。 4. 蛋白质含量计算 可溶性蛋白含量（ mg/g ）=(C VT)/1000VS （ mg/g ） C—查标准曲线值， g； VT —提取液总体积， ml； WF—样品鲜重， g； VS—测定时加样量， ml 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！ 精品