第四章酶学分析技术PPT课件.ppt

1 第四章　 酶学分析技术 2 酶（enzyme）的本质： 高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性 酶的应用： 由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂 酶的特点： 酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临 床诊断和疗效判断 3 主要内容： 酶活性测定的基本知识 酶活性单位的计算与校准 酶活性的测定 代谢物的酶法检测 同工酶测定 4 掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。 了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用。 教学要求： 5 第一节 酶活性测定的基本知识 酶测定 绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 E E 6 简介内容： 一、酶活性 二、酶活性单位与酶活性浓度 三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学 7 一、酶活性 定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。 表示方法： 　 　或　 式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。 8 二、酶活性单位与酶活性浓度 （一）酶活性单位 定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法： 惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 国际单位IU（µmol/min） Katal单位（mol/s） 9 1．惯用单位： 20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen） 特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82  10-4μmol NADH为一个卡门氏单位 举例： 金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。 10 2.国际单位IU（µmol/min） 定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。 IFCC,2001年 37℃ 3．Katal单位 定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal＝1mol/s。 IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal 11 （二）酶活性浓度 酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性. 12 三、酶促反应进程 以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线） 13 （一）延滞期（lag phase、延迟期 ） 特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟 t1 t2 　　 时间t 图5-1　酶促反应进程曲线 吸光度A 线性期 非线性期 R1 R2 延滞期 孵育期 延滞期 14 （二）线性期 此阶段酶促反应速率基本保持恒定； 对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比 ； 此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。 酶活性浓度越高，线性期就越短 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度 。 线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％ 线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性 特点：可代表酶促反应速度 15 （三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ） 进入非线性期的原因： 反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。 特点： 若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 成正比，为一级反应。 16 四、酶促反应动力学 研究内容