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核酸杂交技术全解第1页/共62页目 录第一节 核酸分子杂交的概念一、核酸探针二、分子杂交信号检测第二节 经典的核酸分子杂交技术一、固相杂交二、液相杂交第2页/共62页目 录第四节 影响杂交信号检测的因素一、探针的选择二、探针的标记方法三、探针的浓度四、杂交率五、杂交温度六、杂交的严格谨性七、杂交反应时间八、杂交促进剂第3页/共62页核酸分子杂交(molecular hybridization of nucleic acid)核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。第4页/共62页第一节 核酸分子杂交的概念变性 退火 复性第5页/共62页核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 第6页/共62页2、融解温度 (Melting Temperature, Tm)定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。影响Tm的因素： （1）DNA碱基的组成 G-C含量越多Tm值越高 A-T含量越多Tm值越低 （2）溶液的离子强度 低离子强度Tm值越低 高离子强度Tm值越高 （3）pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH4, pH11不利于氢键形成 （4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成第7页/共62页3.复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度第8页/共62页重点提示 分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。第9页/共62页一、核酸探针 核酸探针指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。第10页/共62页（一）常用探针的种类寡核苷酸探针DNA探针基因组DNA探针cDNA探针探针的种类RNA探针第11页/共62页1. DNA探针 最常用的核酸探针三大优点：① 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便；② DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地被抑制；③ DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。 第12页/共62页探针优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 缺点：易降解，标记方法复杂 。第13页/共62页3.寡核苷酸探针寡核苷酸探针一般由17～50个核苷酸组成。优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针杂交的特异性。第14页/共62页（二）探针的长度和RNA探针 DNA探针通常为400～500个碱基2. 寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性第15页/共62页（三）核酸探针的标记 1. 探针标记物的选择（1）放射性标记（2）非放射性标记根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。第16页/共62页不同标记类型探针的比较： 优点缺点放射性探针可以准确定量；灵敏度高；本底低；易于除去旧探针,重新杂交新探针短半衰期的探针需临用前制备；放射性递减使探针降解；放射性物质对人体有害；费用贵非放射性探针对人体危害小；稳定，可供长时间内持续使用；检测过程快；可同时进行不同标记探针的杂交；本底较低灵敏度不如放射性探针；杂交条件受报告基团的限制；重新杂交新探针比较困难第17页/共62页2.探针标记方法的选择 制备探针步骤：探针标记清除未标记的核酸探针检测探针标记效率 核酸探针的标记方法(1) DNA切口平移标记法(2) DNA随机引物标记法(3) DNA的末端标记(4) cDNA探针的标记(5) 寡核苷酸探针的标记(6) 单链DNA探针的标记(7) RNA探针的标记第18页/共62页（1）DNA随机引物标记随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。DNA聚合酶ⅠKlenow片段：保留5’→3’DNA聚合酶活性,弱3’→5’外切酶活性，无5’→3’外切酶活性。3 ′第19页/共62页5 ′切口原始位置DNase I，Mg2+变性DNA聚合酶I32P-标记的DNA5 ′3 ′切口