毛细管电泳课件.pptxVIP

毛细管电泳课件第1页/共52页第一节 毛细管电泳概述毛细管电泳（CE），又称高效毛细管电泳，是近年来发展最快的高效分离分析技术之一。该技术是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物，是气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等常用分离技术的重要补充，在诸多研究领域得到了人们广泛的接受和认可。第2页/共52页一、毛细管电泳发展历程1808年，俄国物理学家 Pence 发现电泳现象。1937年，瑞典Tiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定,第一次从人血清提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白，但分离效率低；1981年，Jorgenson在75 μm毛细管内施加300 V/cm的高强度电场，获得了理论塔板数超过400,000 plates/m的高分离效率，轰动了整个分离界，成为CE划时代里程碑1989年，毛细管电泳仪问世。 1989年，第一届CE国际会议的召开，标志着一门新的分析技术的产生。第3页/共52页二、毛细管电泳的特点 CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物，具有较HPLC和平板凝胶电泳更多的优点：(1)高效：每米理论塔扳数低则十几万，高则几百万甚至上千万；(2)快速：可在十几分钟甚至几十秒内完成分离；(3)低样品消耗：只需纳升甚至皮升级样品量；(4)低成本分析：只需低廉的分离毛细管和少量的运行缓冲液；第4页/共52页(5)高度自动化：CE是目前自动化程度最高的分离分析方法之一；(6)洁净：通常用水溶性缓冲液，对人体和环境无害；(7)多分离模式：可根据需要在同一仪器上选用不同的样品分离模式；(8)应用范围广：具有“万能”分析的功能和潜力，既可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子，又可以分析蛋白质等生物大分子,甚至整个细胞。—+第5页/共52页第二节 毛细管电泳基础理论—+第6页/共52页一、电泳流电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。电泳时，不同离子在电场中具有不同的定向迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？淌度(μ）：单位电场下的电泳速度。绝对淌度：在无限稀释溶液中测得的淌度。 有效电泳淌度：在实际溶液中测得的淌度。第7页/共52页电场强度：与所施加的电压成正比，与两电极间的距离（L）成反比 E=V/L电场力：在溶液中，电场对带电离子作用力（F）的大小等于带电离子所带的净电荷（q）与电场强度的乘积：F=q·E在电泳迁移过程中，介质粘滞力（F’）必然会阻碍离子的迁移。粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系，与带电离子的移动速度更是直接相关。对于球形分子F’的大小服从Stokes定律：F’=6πηrνef η：缓冲液粘度；r：球形分子的半径；νef：离子在电场中的迁移速度。第8页/共52页当带电离子以速度v在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场驱动力和移动摩擦阻力的作用，此时F=F’故：q·E= 6πηrνef则离子在电场中的迁移速度：即带电离子的电泳迁移速率（或称电泳淌度） :由此可知，球形带电离子的迁移率，主要取决于自身状态，即与其所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。电泳过程中正是利用带电离子电泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。 第9页/共52页二、电渗流石英毛细管柱，内壁大约有8.31 ?mol/m2的硅醇基（Si-OH），其等电点约为，内充液pH3时，表面电离成SiO-，管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗流。式中， 为电渗速度； 为电渗淌度（EOF mobility）； 为双电层的Zeta电位； 为缓冲液介电常数；η为电解液粘度；V为所施加的电压； 为毛细管总长度。第10页/共52页1. CE中电渗流的大小与方向 电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。 （1）电渗流的大小电渗流的大小与电场强度、Zata电势及缓冲液介电常数有关，某一电泳体系内电渗流的具体数值可以用Helmholtz-Smoluchowski 公式计算：第11页/共52页在具体实验中，可根据需要选用不同的中性组分作为标记物（N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等），测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间，按下述公式计算出电渗率： 其中，t：中性标记物的迁移时间，ldet为毛细管电泳有效长度， ltot为毛细管电泳有效长度。 第12页/共52页（2）CE中电渗流的方向石英毛细管带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：毛细管改性：表面键合阳离子基团；加电渗流反转剂: 内充液