琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法培训讲学.pptVIP

紫外透射检测仪 * * * 词语：一个 拼音：yī ɡè 解释：表数量。单个。用于人和各种事物。如：一个人；一个书柜；一个学校；一个理想；一个星期；一个地方。整个。如：他今天一个上午都没歇过。如：今年一个冬天没下过雪。用在动词和补语之间，表示程度。如：吃了一个饱；看了一个够；淋了一个透。跟名词、动词结合，用在谓语动词前，表示快速或突然。张天翼《儿女们》：“黑云越堆越重，拚命往下沉，一个不留神就得塌下来。”沙汀《丁跛公》：“昨天在一家买卖田地的酒席上，一个不提防，给两三个熟人，灌醉来躺下了。”祖慰《被礁石划破的水流》：“我扭头就走，真怕她一个箭步追上来。” * Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性 常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。 * * （配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 * * 实验三琼脂糖凝胶电泳技术的原理(yuánlǐ)和方法 主讲(zhǔjiǎng)教师和实验员：张运峰 第一页，共20页。 一 实验(shíyàn)目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测碱裂解法提取质粒的结果 检测双酶切法鉴定(jiàndìng)重组质粒的结果（后续实验） 检测PCR法鉴定(jiàndìng)质粒的结果（后续实验） 第二页，共20页。 二 实验(shíyàn)原理 （1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子(fēnzǐ)大小和构型有关。 DNA分子(fēnzǐ)在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子(fēnzǐ)质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子(fēnzǐ)或线性分子(fēnzǐ)，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子(fēnzǐ)。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙(kǒngxì)越小，其分辨能力就越强。 第三页，共20页。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨(fēnbiàn)能力就越强。 （3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成(xíngchéng)EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。 表1 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分子大小(dàxiǎo)的关系 第四页，共20页。 三 仪器、材料(cáiliào)与试剂 1.质粒样品、酶切样品和PCR样品。 2.凝胶电泳系统(xìtǒng)和电泳图像分析系统(xìtǒng)(凝胶成像系统(xìtǒng))等。 3.琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液、Goldview、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（Marker ）等。 第五页，共20页。 1.凝胶电泳系统(xìtǒng) DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出(shūchū)范围（显示分辨率）：6-600V(1V)???? 4-400mA?(1mA)????240W 美国Bio-rad伯乐 小型(xiǎoxíng)水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell 第六页，共20页。 ?2.凝胶成像分析(fēnxī)系统 第七页，共20页。 3.Marker 一个已知分子质量的DNA样品做最对照(duìzhào)，用来确定待测样品的相对分子质量。 第八页，共20页。 4.常用(chánɡ yònɡ)电泳缓冲液 缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 最快 (高10％) 高分子量高 高度复杂DNA混合物；超螺旋DNA TBE 很高 较慢 低分子量高 价格昂贵，不常用 TPE 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作(cāozuò)更方便。 5.上样缓冲液 第九页，共20页。 4.常用(chánɡ yò