常见猪病检测方法.docxVIP

猪病诊断技术规范 、致病性大肠杆菌的检测 引用标准 参考 NY/T555-2002 (动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法)。 范围 适用于猪大肠杆菌病的诊断。 检测方法 材料 营养肉汤 营养琼脂 3.1.3EMB 3.1.4TSI MViC 生化鉴定管 白鼠 分离培养 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板(同时接种营 养肉汤增菌备用)，置 37℃培养 18~24h。 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜 检。 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌， 应取 5~10 个典型菌 落再接种于 TSI 琼脂。 同时挑取典型菌落接种营养琼脂， 37℃培养 16~18h 的菌液用于生化特性鉴定。 生化鉴定 挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管,(36 ± 1) C培养24h后观 察结果。 靛基质试验： a)滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。 b) 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。 4 4药敏试验 4 4药敏试验 甲基红（MR）试验 a）滴加甲基红指示剂0.2mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。 b）出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。 VP 试验 a）滴加VP试剂甲液0.2mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1mL 混匀，静置，观察结果。 b）在15min内出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果 1h 后再观察一次，出现红色也为阳性反应。 枸檬酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。 大肠杆菌鉴定结果 应符合表1要求。 表1大肠杆菌鉴定结果 靛基质 MR VP 枸檬酸盐 鉴定 + + - - 典型大肠埃希氏杆菌 - + - - 非典型大肠埃希氏杆菌 + + - + 典型柠檬酸盐杆菌 - + - + 非典型柠檬酸盐杆菌 - - - + 典型产气杆菌 + - - + 非典型产气杆菌 出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌 如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。 致病性试验 a）取经营养肉汤37c培养16~18h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重 20g 左右的小白鼠，每株接种2~3只，每只0.3mL （含菌量约为1 x 1012cfu/mL）, 同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。 b）饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在 24小时内出现 死亡的可报告为致病性大肠杆菌。 a）挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中， 37c培养16?18h,菌液用于药 敏试验。 b）将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为 1xi09cfu/ mL ， 摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上， 然后用无菌镊子将药敏片贴附 其上，每纸片2?5张，置37c培养24 h后观察。 c） 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。 二、沙门氏菌的检测 引用标准 参考 NY/T550-2002 （动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。 范围 适用于猪沙门氏菌病的诊断。 检测方法 材料 3.1.1SC 3.1.2DHL 3.1.3TSI 赖氨酸脱羧酶（ LD） 邻-硝基酚-B-D-半乳糖甘（DNPG） 甘露醇糖发酵管 分离培养 a） 采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。 b）无菌剪取肝、脾样品1g,投入10mLSC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量 直接投入 10mL 增菌液）， 36± 1℃培养 18~24h。 c） 取一接种环增菌液划线接种于 DHL 琼脂平板上， 36± 1℃培养 18~24h。 观察平 板上菌落生长形态。 沙门氏菌在 DHL 平板上呈无色半透明， 产硫化氢 （ H2S） ， 菌落中心黑色或几乎全黑色。 3.3生化鉴定 a） 挑取 DHL 平板上可疑菌落 3~5个，每个菌落先洗入 TSI 培养基冷凝水中，继 而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。 b）再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱竣酶发酵试验（LD）和ONPG,甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取 TSI 培养基中冷凝水接种其余生化管，36±1C培养18~24h （挑取菌落后的平板， 应置于4 c冰箱保留48h以备复查）。 c）按表1记录反应结果，对照表2进行判定。 d）凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。 表1生化反应结果判定 生化管 TSI LD ONPG MAN 底a 斜面b 硫化氢 第一次颜色 记录符合 黄 + 黄 + 黑 + 紫 + 深黄 + 黄 + 第二次颜色 记录符号 红 - 红 - 无黑色 - 黄 - 无色或淡 黄 - 紫 - a