31DNA重组技术的基本工具上课.pptxVIP

专题1 基因工程记一记一、基因工程的概念 指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平剪切→ 拼接→ 导入→ 表达基因重组人类需要的生物类型和生物产品1.1 DNA重组技术的根本工具 DNA重组技术的根本工具工欲善其事,必先利其器.想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢? 实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀〞 (1)来源: (2)化学本质： (3)作用 (4)作用特点：(5)切割方式主要从原核生物蛋白质识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。特异性，即识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端2021/7/1154132 T51423 A磷酸二酯键限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 图1-1 限制酶识别序列的中心轴线当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。黏性末端 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的切割：大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。在G与A之间切割中轴线黏性末端黏性末端平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。C C C G G GG G G C C CSmaI限制酶的切割：只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线思考题：要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。 是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了?实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。2、ＤＮＡ连接酶——“分子缝合针〞E·coli DNA连接酶（黏性末端）T4 DNA连接酶 （黏性末端和平末端）种类：作用部位：不是氢键。是磷酸二酯键， 将双链 DNA片段“缝合〞起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ,这样一个重组的DNA分子就形成了。E·coliDNA连接酶与T4DNA连接酶比较：功能类型来源E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶相同点差异大肠杆菌只能连接黏性末端恢复磷酸二酯键能连接黏性末端和平末端(效率较低)T4噬菌体记一记DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链连接部位相同点双链单链将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键在两DNA片段之间形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键二者都由蛋白质构成DNA连接酶与DNA聚合酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板形成磷酸二酯键限制性内切酶与解旋酶的区别限制酶解旋酶区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键翻开形成两条单链D据右图所示，有关工具酶功能的表达不正确的选项是〔　 〕A. 限制性内切酶可以切断a处，DNA连接酶可以连接a处B. DNA连接酶可以连接a处C. 解旋酶可以使b处解开D. 连接b处的酶可以为DNA连接酶记一记3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车〞〔1〕载体的作用将外源基因转移到受体细胞中去。运载体对外源基因进行大量复制。〔2〕作为载体必须具备的条件能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。必需是平安的，不会对受体 细胞有害。大小应适合，便于提取和操作〔3〕常用的载体 质粒 λ噬菌体衍生物 动植物病毒常用的载体：质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物细胞中。是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA或细胞核之外自我复制的很小的双