T细胞及B细胞的分离 .docxVIP

PAGE PAGE 1 T细胞及B细胞的分离 试验中常需要从淋巴细胞群中分别出单一的T细胞或B细胞，以便更深化地讨论T,B细胞的生物学特性和功能。目前常用的分别办法有免疫磁珠分别法和免疫吸附法，近年来应用流式细胞仪可以分别出均质性的单一细胞类型或亚群。 （一）免疫磁珠法分别T细胞和B细胞【原理】用特异性抗T细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic beads)，这种免疫磁珠可于磁场中结合淋巴细胞悬液中的T细胞，而未结合的B细胞和其他细胞被洗脱下来。免疫磁珠法分别细胞具有纯度高（普通为95％～99%）的特点。其分别效果可媲美流式细胞仪，并具有比流式细胞仪分别术经济、便利省时、容易迅速等优点。【材料】1．淋巴细胞悬液；2．磁性激活细胞分别器（MACS) MACS柱（C型，可结合2x108个细胞）；3．生物素标志的磁性微珠；4．生物素标志的抗CD4和抗CD8单克隆抗体及生物素标志的羊抗鼠IgG F(Fab)2;5. MACS柱染色洗涤液、MACS柱洗脱液（含1％牛血清清蛋白的PBS)和MACS柱；FITC标志的亲和素；6．培养液及试剂 RPMI 1640细胞培养液，浸湿液（含10％牛血清清蛋白的PBS)。【办法】1．新MACS柱需高温高压灭菌，烘干后备用。将C型MACS柱内分离用10ml注射器在柱下三通阀门处加入10ml MACS柱浸湿液，使液面达到柱内铁丝基质平面上2～3cm处，关闭柱下三道阀门备用。2．淋巴细胞悬液（2x108/ml）离心（1500r/min,5分钟），重悬于0.15ml MACS染色洗涤液中，加入生物素标志的CD4单抗和抗CD8单抗各25ul（比例为0. 05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重悬于0.15m1 MACS染色洗涤液中，加入50ul生物素标志的羊抗鼠IgG F (Fab) 2（比例为0.05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重新悬浮于0.15ml MACS染色洗涤液中，加入50ul FIX标志的亲和素（比例为0.08ug/106个细胞），冰浴孵育15分钟。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重新悬浮于0.15m1 MACS染色洗涤液中，加入生物素标志的磁性微珠（比例为5ul/108个细胞），冰浴孵育5～10分钟。然后加入3m1 MACS柱洗脱液。3．将MACS柱放入MACS磁铁槽内，用20ml MACS柱洗脱液洗柱，待液体降至柱内铁丝基质平面上2～3cm处，关闭三通阀门。将细胞悬液置于MACS柱内。在柱下放一支50ml的试管，打开阀门，使其流速为3～5m1/min，边流边加MACS柱洗脱液，每个柱内起码加柱洗脱液30ml。试管内的洗脱液中为CD4-CD8-细胞（即阴性分别）。离心洗涤后调节细胞至所需浓度备用。【结果】将MACS柱移出磁场外，用MACS柱洗脱液洗柱（较大流速），则该洗脱液中为CD4-,CD8+或CD4+CD8+细胞（即阳性分别）。离心洗涤后调节细胞至所需浓度备用。为了进一步提高细胞分别纯度，可再用另外两个MACS柱重复上述过柱过程并用流式细胞仪举行分析测定。【注重事项】1. MACS柱用尽毕后需立刻用双蒸水冲洗整洁，再以20倍于柱体积的无菌双蒸水和5倍于柱体积的95％溶液洗涤，37℃下烘干，高压灭菌以备再次用法。2．不要将大团细胞加入柱内，以免造成阻塞进而毁坏MACS柱。3．洗脱MACS柱时，流速越慢则分别细胞的纯度越高。在MACS柱上加入液体时不要产愤怒泡。4．在分别洗脱时，柱内液体不要低于柱内的铁丝基质平面以下，即始终让铁丝基质内含有液体，否则细胞分别将彻低失败。5．假如分选的细胞还需要举行培养，全部的器材和液体均应无菌。MACS分别过程应在超净工作台内完成操作。（二）用尼龙毛柱分别T细胞和B细胞【材料】尼龙毛柱的制备（注重无菌操作）：1．取直径3D，长度约10cm的尼龙毛（聚酞胺纤维），用0.2mo1/L HCl浸泡过夜，用双蒸水洗净HCl，置37℃烘干备用。2．称取50mg尼龙毛，匀称簇拥后置Hanks液中浸泡。取1 ml注射器，出口接塑料管并夹住，将尼龙毛匀称填塞入注射器中，排净空气，柱高5～6cm。此柱可分别约2x107细胞。【办法】1．取PBMC，用含10％的RPMI 164。培养液将细胞配成2x107/0.5ml。2．用5 ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。将0.5 ml上述PBMC悬液加入尼龙毛柱中。待细胞悬液所有进入尼龙毛柱后，立刻加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。3．在37℃,5%