EBER原位杂交过程.pdf

预先准备的试剂 胃酶浓缩液： 将胃酶中加入 4 毫升的蒸馏水或去离子水， 充分溶解后可根据使用量分装， 冻 存〔 -20 ℃〕。 胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的 1N HCl 用蒸馏水或去离子水 10 倍稀释，即成 0.1N HCl 溶液 PBS 配制： 将一袋 PBS 粉末溶于 1000 毫升双蒸水， 彻底溶解后加入 Tween 20 5 滴，混匀后 使用。 DAB 工作液配制：在 1 毫升 5A 中加入 50 微升的 5B ，临用前配制，未用完的液体应弃去。 也可按照上述比例，根据实际需要量配制。 胃酶消化工作液的配制 每 1cm2 的切片按照 300-400 微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作 液应弃去。 石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至 0.1N 的 HCl 溶液 100 倍稀释，例如可 将 15 微升的分装胃酶浓缩液加入到 1.5ml 的 0.1N HCl 溶液中，混匀后备用。 所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行， 防止试剂蒸发。 一旦杂交程序开始， 玻片不能干 燥。 样品的收集和预处理 石蜡切片： 常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过 12 小时。石蜡包埋的温度不宜超过 65 ℃。 4-6 微 米的石蜡切片， 56-60 ℃烤片 2-16 小时。处理好的切片可以立即使用，也可放置于室温条件 下保存〔至少可保存 3 个月以上〕 。在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡〔 10 分钟 ×2 〕。脱蜡后的切片在新鲜 100% 乙醇中放置 5 分钟后， 经空气干燥 5-10 分钟即可进行酶处 理。 酶处理〔防止 RNA 酶污染，带手套操作〕 将切片放置于 37℃中，每张切片加入 300-400 微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片 孵育 30 分钟。弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水〔 70% 、95%和 100% 〕，每个梯度放置 1 分钟。空气干燥后杂交。 杂交程序〔防止 RNA 酶污染，带手套操作〕 杂交： 混匀探针溶液，在每张切片上加 10-20 微升适量的探针〔试剂 3 〕，加盖盖玻片〔注意防止 气泡！〕。湿盒中 37℃孵育 2 小时，杂交过夜效果更好。 冲洗： 将切片浸入 PBS 缓冲液中 10 分钟，直到盖玻片自然脱落，用 PBS 缓冲液冲洗切片 2 分钟 ×3 次，取出切片，擦干多余的缓冲液。 检测和显色程序 切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体〔试剂 4 〕，37℃孵育 30 分钟， PBS 冲 洗 1 分钟× 3 次〔期间可摇动容器数次〕 ，用蒸馏水或去离子水冲洗切片 1 分钟× 1 次。 擦净切片边缘的水分， 加入适量配制好的 DAB 工作液。 显色 5-15 分钟， 注意光镜下观察显 色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片 1 分钟× 3 次后，即可进行封片或复染。 复染程序 可苏木素复染，染色约 5-10 秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗，常规脱水、透明，封片。 无阳性表达可能原因： 1．塑料制品：尽可能使用无菌、一次性塑料制品。已标明 RNase-free