核酸探针技术及应用.(精选).pdf

核酸探针技术及应用 基因检测技术的发展， 使对某些疾病的诊断达到了特异性强、 敏感性高及简便快速的目 的。近年来各种血清学方法发展很快， 但血清学方法主要是测抗体， 是间接的证据随着分子 生物学的发展，应用 DNA— DNA杂交建立了核酸探针 (Probe) 技术，该技术是目前基因检测最 常用的方法， 目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性， 法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。 本文主要 介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。 一、核酸探针技术的原理 DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的 DNA 片段， 能与互补的核苷酸序列特异结合， 这 种用同位素非同位素标记的单链 DNA片段即为核酸探针。 核酸探针技术是将双链 DNA经加热或硷处理， 使硷基对间的氢链被破坏而变性， 解开成 两条互补的单链。 它们在一定温度和中性盐溶液条件下， 又可按 A— T，G— C碱基配对的原则 重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股 DNA是互补 ( 同源 ) 或部分互补 ( 部分同源 ) 的 条件下才能实现。正是由于双链 DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链 DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜 上的变性单链 DNA进行杂交， ( 另一条 DNA链与核酸探针是配对碱基， 称为靶 ) 再用放射自显影 或其他显色技术检测，以确定有无与探针 DNA ( 或 RNA)同源或部分同源的 DNA(或 RNA)存在。 因为探针只与靶病原体的 DNA或 RNA杂交，而不与标本中存在的其他 DNA 或 RNA杂交。 二、核酸探针技术的基本方法 被检标本用去污剂和酶分解以去除非 DNA成分或直接提取 DNA，用各种方法处理 DNA使其 变性， 把 DNA双螺旋的两条链分开，单链 DNA结合于固态基质上， ( 如滤膜 ) 使其固定。 再加上 已制备好的探针进行杂交， 探针便可找出已固定的 DNA中的互补序列， 与之配对结合， 然后 洗掉未结合部分， 由于探针已将放射性同位素掺入， 再用 x 射线敏感的胶片自显影， 见黑色 3 影印者即为阳性。探针亦可用 H标记，最后用液闪计数器计致。还可用生物素，抗生物素等 标记，最后用酶标法显色，均能得到满意效果。 1 核酸探针的制备 核酸探针可分为 DNA探针、 CDNA探针、 RNA探针和寡糖核苷酸探针， 因其种类不同制备方 法也不同。 1．1 DNA探针 DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针的制备最简单，只要将染 色体 DNA分离纯化， 然后进行标记即可。 基因片段探针则需要将染色体 DNA用限制性内切酶酶 解， 得到许多随机片段，然后与质粒重组，转化大肠杆菌 (E ·coli) ，筛选含特异目的基因 片段的克隆株进行扩增，再提取基因片段作探针。 1．2 CDNA探针 通过提取纯度较高的相应 mRNA或正链 RNA病毒的 RNA， 反转录成 CDNA作为探针。也可以 进一步克隆在大肠杆菌中进行无性繁殖，再从重组质粒中提取 CDNA作探针。 1．3 RNA探针 有些双链 RNA病毒的基因组在标记后，