DNA提取及PCR扩增实验报告.docxVIP

精品文档 PCR扩增及 DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学 一、实验目的 1．学习并掌握 PCR扩增的基本原理与实验技术。 2．对扩增后的 DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR 扩增 多聚酶链反应（ PCR）技术的原理类似于 DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适 量缓冲液，加入微量模板 DNA、四种脱氧核苷酸（ dNTP）、耐热 Taq 聚合酶及两个合成 DNA 的引物，而后加热使模板 DNA在高温下（ 94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低 溶液温度， 使合成引物在低温（ 55℃ ）与模板 DNA互补退火形成部分双链， 这是所谓退火阶 段。溶液反应温度升至中温（ 72℃ ），在 Tap 酶作用下，用四种 dNTP为原料，引物为复制起 点，模板 DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链， 这是延伸阶段。如此反复，在 同一反应体系中可重复高温变性、 低温退火和 DNA合成这一循环， 使产物 DNA重复合成， 并 在重复过程中， 前一循环的产物 DNA可作为后一循环的模板 DNA而参与 DNA的合成， 使产物 DNA的量按指数方式扩增。经过 30～ 40 个循环， DNA扩增即可完成。 2. DNA 琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电， 在电场中向阳极移动。 在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。 DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 不同构型的 DNA分子的迁移速度不同。 该电泳方法 以琼脂凝胶作为支持物， 利用 DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应， 达到分离混合物 的目的。 三、实验材料 仪器： PCR扩增仪、 0.2ul 薄壁管、 1.5ml 离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。 试剂： TapDNA聚合酶、 dNTP、buffer 、两种引物、 16S 全长 DNA样本、无菌 ddH2O、模 DNA 、 TBE、琼脂糖、 EB、显色剂。四、 实验步骤 1. PCR 扩增 本次试验选择细菌 16S rDNA V3 区片段进行扩增。 1.1 根据计算，首先取 1.5ml 离心管按照 2.5ul 10 × Buffer 、 1 ul dNTP、0.5 ul 341GC 、 0.5 ul 534 、 0.125 ul Taq 、19.375u ddH 2O的比例配置足量的 PCR反应体系。 1.2 分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul 的反应体系，并分别添加 8 种不同的模版，并于第 9 个薄壁管中加入无菌 ddH2O作为阴性对照。 1.3 将薄壁管放入 PCR扩增仪中，按照预定程序进行 PCR扩增。其中循环过程需要达到 30~40 次。程序如下： 预变性： 94 ℃ 3min 循环： 94 ℃ 变性 30s ℃ 退火 30s ℃ 延伸 30s 末次延伸： 72℃ 5min 1.4 PCR 扩增完成后，将样品取出并保存于 15℃环境中。 。 1 欢迎下载 精品文档 DNA 琼脂糖凝胶电泳实验 2.1 称取 0.2g 琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的 0.5 ×TBE电泳缓冲液。然后置微 波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至 60℃ 左右，在胶液内加入适量的 EB。 2.2 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60℃左右的胶液，使 之形成均匀水平的胶面。 2.3 待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。 2.4 在槽内加入 0.5 ×TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取 1μl 缓冲液和 5μl 待测 DNA 样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。 2.5 接通电泳仪和电泳槽， 并接通电源， 调节稳压输出， 电压最高不超过 5V/cm，开始电泳。 点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。 2.6 观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约 1cm处，可停止电泳。 2.7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。 关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。 五、实验结果与讨论 如图所示：从左至右，分别是模版 1-8 号，第 9 列为阴性对照。 前 8 列均有明显的条带出现，而阴 性对照无显示，说明扩增整体效果很 好。图中有上下两条线，上面一条线所 覆盖的条带基本可以代表扩增的产生 的片段位置，参照图可以看出扩增片段 在 200bp 左右。在第 9 个阴性对照的第 二条线处可以看到较为模糊的条带，并 非是出现假阴性，而是由于二聚物而产 生的条带。通过该条带与最右侧的 marke