BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用.docVIP

BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用 1 1材料和方法 2 文2：铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达 6 1 材料和方法 7 2 结果与分析 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用 文1：BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用 0引言 乳腺癌是西方妇女最常见的恶性肿瘤，发病率约为10%［1］，死亡率高达30%［2］. 我国发病率低于西方国家，大约2%-3％，但近年来呈快速上升趋势，在上海、天津及沿海地区已成为女性发病率最高的恶性肿瘤［3］. 目前研究最多的遗传因子是乳腺癌抑制基因brCA1［4］和brCA2［5，6］. brCA2基因突变携带者发生乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌的危险性显著高于正常人群［7］，brCA2参与双链DNA断裂损伤修复、维持染色体稳定、转录调控等细胞功能［ 8-10 ］. FHL2是1998年Chen等从胎儿心脏cDNA文库克隆的一个单纯LIM结构域蛋白，含4个半LIM结构域而得名（Four and half LIMonly protein2, FHL2） 我们采用酵母双杂交系统筛选正常人乳腺上皮细胞文库，发现FHL2是brCA2相互作用蛋白之一，不仅哺乳细胞双杂交证实了体内结合，而且还发现二者有转录激活协同作用，为brCA2和FHL2的功能研究提示了新的方向. 1材料和方法 材料HA109酵母细胞；酵母双杂交系统－3全套质粒（pGBKT7, pGADT7 , pCL1, pGADT7T, pGBKT753, pGBKT7Lam）；哺乳细胞双杂交系统质粒(pM, pVP16, pM53, pVP16T, pVP16cp）；酵母培养基（YPDA）及筛选培养基（SD）、多种氨基酸、XαGal, XβGal, LB培养基、酵母质粒DNA提取kit（clontecl#K16111）等购自CLONTECH 公司；293T细胞购自ATCC（美国组织培养中心） 方法 酵母双杂交系统‘钩’质粒的构建以pUC19/brCA2质粒（哈佛大学Sam Lee博士惠赠）为模板，采用Stepdown PCR扩增brCA2 3′片段（7900~10 808 bp, C3），并掺入限制性酶切位点, 扩增产物经10 g#12539;L-1琼脂糖凝胶电泳分离，采用DNA回收试剂盒(Qigene公司，美国)回收PCR产物片段及载体pGBKT7质粒DNA. 连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含卡那霉素的LB培养板培养、筛选阳性克隆、提取质粒DNA进行酶切鉴定、序列分析证实. 酵母双杂交系统筛选参照MATCHMAKER GAL4双杂交系统3操作流程进行(MATCHMAKER GAL4 TwoHybrid System3 Libraries User Mannual. PT32471, Clontech, USA) 哺乳细胞双杂交方法验证brCA2/FHL2体内结合将brCA2/C3片段及FHL2基因分别克隆到哺乳细胞双杂交载体pM和pVP16中，Ca3（PO4）2沉淀法转染293T细胞，CO2孵箱37℃培养48 h，收集细胞，采用荧光酶检测试剂盒（CLONTECH公司）检测转染细胞的荧光酶活性. 免疫共沉淀法分析FHL2与brCA2的体内结合分别构建表达含Flag标签的C3和含Myc标签的FHL2的真核载体pEF/brCA2C3flag (pEF/brCA2C1/C2两个质粒编码较短的C端片段作为对照)和/FHL2myc, 各用10 μg氯化铯纯化的质粒DNA，磷酸钙沉淀法转染293T细胞. 48 h后收集细胞,用含10 g#12539;L-1 FMSF的LSAB缓冲液溶解，振荡、离心取上清，加入10 mg#12539;L-1 抗Flag单克隆抗体（M9, Sigma公司）4℃孵育过夜， 加入蛋白G微珠, IP缓冲液(50 mmol#12539;L-1 TrisHCl , 150 mmol#12539;L-1 NaCl, 5 mg#12539;L-1 NP40, g#12539;L-1 BSA, 10 mg#12539;L-1 PMSF)漂洗6次, 90 mg#12539;L-1 SDSPAGE电泳，转移到尼龙膜，用辣根过氧化物酶偶联抗Myc单克隆抗体（Sigma公司）进行Westernblot反应，ECL系统检测. 对brCA2基因的转录激活作用pM/FHL2, pEF/brCA2真核表达载体和pG5luc荧光酶报道质粒共