辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制.docVIP

辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制 1 1材料和方法 2 文2：活血化瘀中药复方诱导K562细胞凋亡 6 1材料和方法 6 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制 文1：辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制 0引言 慢性粒细胞白血病(CML)融合基因bcabl编码产物P210bcabl可激活Ras, PI3K, STATs等多条信号途径. 辛伐他汀对慢性粒细胞白血病细胞的作用机制多限于体外研究，有必要观察和探讨其在实验动物体内的效果和作用机理. 而且，p21ras和PI3K的上游激活可启动BcrAbl诱导的转化，其下游靶标仍未完全清楚［1］. 我们用辛伐他汀作用裸鼠体内K562细胞，检测它对裸鼠体内K562细胞的影响，以说明辛伐他汀是否通过引起裸鼠体内K562细胞中Ras分子和Ras下游的PI3KAKT信号通路的分子水平的变化来诱导K562细胞凋亡的发生. 1材料和方法 材料 12只健康裸鼠，雌性，4+周龄，购自四川大学华西医学中心，并饲养于SPF标准的实验室. 辛伐他汀购自 中国 药品生物制品检定所，以无水乙醇溶解后，再加入与辛伐他汀等摩尔的NaOH，50℃水浴2 h，调整pH值至，过滤除菌，调节浓度至 g/L备用. 噻唑蓝、二甲亚砜购自Sigma公司，培养基和胎牛血清购自Gibco公司，TUNEL试剂盒为美国Roche公司产品. Trizol 和逆转录试剂Rever TraAce购自Bioflux公司，扩增的基因引物由英骏生物技术有限公司合成，PCR试剂由北京天为时代科技有限公司提供. 方法 细胞培养 K562细胞购自四川大学华西医学中心，以含100 mL/L灭活小牛血清，100万U/L青霉素，80万U/L链霉素的RPMI 1640培养液于37℃, 5 mL/L CO2培养箱中培养. 慢性粒细胞白血病动物模型的构建 取对数生长期的K562细胞用PBS洗涤2次，调整至5×1010/L，于裸鼠右前腋下皮下注射 mL,待接种K562细胞的3只裸鼠身上的肿瘤组织长到2 cm3左右时，处死裸鼠. 取肿瘤组织均匀地分成体积相当的小块组织进行另外12只裸鼠的皮下移植. 待皮下移植的肿瘤组织长到 cm3左右时，将12只裸鼠随机分成3组，对照组4只，腹腔注射生理盐水 mL，处理组分成2个剂量组，各4只，T1组注射 g/L的辛伐他汀 mL，T2组注射 g/L的辛伐他汀 mL. 对照组和处理组隔日分别注射生理盐水和辛伐他汀，连续6次. 原位末端转移酶标记法（TUNEL） 检测肿瘤组织细胞早期凋亡按原位凋亡基因检测试剂盒说明书的步骤进行操作,检测细胞凋亡. 同时设立阴性对照和阳性对照，阴性对照不加Tunel混合液，阳性对照加DNase. PCR检测 RTPCR检测nras, pi3k, akt1, nfκb1 mRNA的差异表达. 取质量相等的肿瘤组织进行冰上匀浆，按照总RNA提取试剂说明书， 加入1 mL Trizol提取总RNA,紫外分光光仪定量. RNA逆转录合成cDNA,逆转录体系40 μL,其中总RNA 2 μg, 42℃水浴50 min,然后进行PCR扩增. 各基因的正义和反义引物序列分别是nras: F 5′3′ TACATCGAGACCTCGGCCAA, R 3′5′ CGTTCACACACGAGAGGACT，产物150 bp； pi3k: F 5′3′ AACTCTGGGGATGACCTGGA，R 3′5′ AGGCGGTCACA ACACTCCTA，产物300 bp; akt1 F 5′3′ AGGGTTGGCTGCACAAACGA, R 3′5′ GTTGTTGA AGAGACACCGCG，产物150 bp; nfκb1: F 5′3′ TGAAGTGAT CCAGGCAGCCT，R 3′5′ CACCTCTGTAGGAAGGCGTT，产物150 bp. pi3k, akt1, nfκb1的内参GAPDH1： 5′3′ACCACAGTCCATGCCATCAC, 3′5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA;产物450 bp；nras的内参GAPDH2：5′3′GGCCTCCAAGGAGTAAGACC，3′5′ AGGGGTCTACAT GGCAACTG，产物147 bp. PCR反应体系为:总体积25 μL, cDNA 3 μL,上下游引物各1 μL, 2×master mix μL,用ddH2O补足