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木黄酮对小鼠胰岛β细胞膜电位的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：木黄酮对小鼠胰岛β细胞膜电位的影响 1 1材料和方法 2 文2：木黄酮对人垂体腺瘤细胞增殖的影响 5 图2略 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 木黄酮对小鼠胰岛β细胞膜电位的影响 文1：木黄酮对小鼠胰岛β细胞膜电位的影响 0引言 葡萄糖引发胰岛素分泌的过程是：在胰岛β细胞，葡萄糖代谢产生的ATP关闭ATP敏感性钾通道（KATP通道），引起细胞去极化，进而激活电压依赖性钙通道，引起Ca2+内流. 胞内Ca2+浓度升高激发胰岛素分泌［1］. 目前已知蛋白酪氨酸激酶在维持胰岛β细胞正常功能中具有重要作用［2］. 蛋白酪氨酸激酶抑制剂木黄酮急性处理胰岛β细胞可引起细胞电活动和胰岛素分泌的改变［3］. 但是，长期降低胰岛β细胞中蛋白酪氨酸激酶活性对葡萄糖引起的胰岛β细胞电活动的影响尚不清楚. 我们用蛋白酪氨酸激酶抑制剂木黄酮预处理原代培养的小鼠胰岛β细胞12 h后，记录了小鼠胰岛β细胞在静息状态下以及受葡萄糖刺激后其膜电位的变化. 1材料和方法 材料雄性C57BL/6J小鼠10只，年龄10~12 wk，体质量20~25 g，由第四军医大学动物实验中心提供. 电生理实验所用设备为Axon公司产品. 木黄酮以及其他所有实验用试剂均购自Sigma公司. 方法 小鼠胰岛β细胞原代培养C57BL/6J小鼠被脱臼处死. 沿胆总管注射Ⅴ型胶原酶液入胰腺. 分离胰腺，37℃消化15 min. 振摇分散胰腺组织，用密度梯度离心法收集胰岛. 胰岛用蛋白酶消化分散为单个细胞［4］. 胰岛细胞种植于35 mm塑料培养皿中，培养在RPMI1640培养液中. 液中加入终浓度为100 mL#12539;L-1的胎牛血清，1×105 U#12539;L-1的青霉素和1×105 U#12539;L-1的链霉素. 细胞随机分为两大组，一组为处理组，用 mmol#12539;L-1木黄酮处理12 h，一组为对照组. 在实验记录时每组细胞又分为两组，一组用于静息电位记录，一组用于观察葡萄糖诱导的膜电位变化. 每组记录细胞数为6个. 电生理实验采用穿孔式全细胞记录的方法记录胰岛β细胞膜电位的变化. 实验中通过灌流系统给药. 电极电阻在充满电极内液后为3~5 MΩ. 电信号采集用Axopatch 200A放大器，数据采集用软件系统. 电极与细胞间的巨阻抗（GΩ）封接形成后，细胞被钳制于-70 mV，补偿电极的电容电流. 在示波器上监测细胞穿孔进展，串联阻抗小于25 MΩ被视为细胞穿孔良好，补偿细胞的串联阻抗和细胞电容电流，形成全细胞钳制状态. 膜电位记录时，细胞被钳制于-70 mV，待形成全细胞状态后，静置细胞10 min. 然后转变至电流钳制状态，开始信号采集. 细胞记录用细胞外液成分为（mmol#12539;L-1）: NaCl , KCl , CaCl2 , MgSO4 , KH2PO4 , NaHCO3 2, HEPES 5, Glucose 2 (pH=). 细胞内液的成分为（mmol#12539;L-1）: K2SO4 76, KCl 10, NaCl 10, MgCl2 1, HEPES 10, Sucrose 36 (pH ). 细胞内液中加入终浓度为 g#12539;L-1的两性霉素B以在细胞膜上穿孔形成全细胞钳制. 统计学处理：各组数据以x±s表示. 采用Wilcoxon秩和检验分析对照组和处理组之间的差异，以P为有显著性差异. 2结果 木黄酮处理减弱小鼠胰岛β细胞的静息电位在2 mmol#12539;L-1葡萄糖状态下，木黄酮处理组的小鼠胰岛β细胞的膜电位较正常对照组明显减小［对照组（-±） mV vs处理组（-±） mV, P, n=6］. 在2 mmol#12539;L-1葡萄糖的基础上加入 mmol#12539;L-1 二氮嗪后（Diazoxide, KATP通道开放剂），正常小鼠胰岛β细胞的膜电位增加到（-±） mV，木黄酮处理组细胞的膜电位增加到（-±） mV，较对照组仍然明显减小（P, n＝6, Fig 1） 木黄酮处理损害小鼠胰岛β细胞对葡萄糖的反应在给予15 mmol#12539;L-1葡萄糖刺激后，小鼠正常胰岛β细胞经过短暂的潜伏期后，其膜电位开始去极化，逐渐升高，并变得不稳定，出现小的波动. 去极化达到近-40 mV时，爆发出明显的动作电位. 动作电位由快速去极化和快速复极化两相组成，动作电位去极化达0 mV左右，时程为80 ms. 动作电位间期的膜电位维持于-40 mV左右. 动作电位发生频率在不同的细胞变化极大，本实验所记录的正